[發明專利]一種純化培養大鼠少突膠質前體細胞的培養基及使用方法

在審

• 申請號: 201711038733.4
• 申請日: 2017-10-29
• 公開（公告）號: CN109722416A
• 公開（公告）日: 2019-05-07
• 發明（設計）人: 鄭華;孫艷;周國民
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N5/079
• 分類號: C12N5/079
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

本發明屬于生物醫學領域，涉及少突膠質前體細胞的培養，具體涉及一種可長期培養大鼠少突膠質前體細胞的培養基配方及其使用方法。首先通過機械離解制作大腦及脊髓細胞懸液，利用原代大鼠少突膠質前體細胞可在多聚賴氨酸包被的培養底物上快速貼壁的特點，獲取富含少突膠質前體細胞的貼壁細胞。在含有PDGF、Purmorphamine、N2添加劑及微量血清的培養基中培養，使少突膠質前體細胞大量增殖。5～6天后，撤除培養基中微量血清2～3天，使少突膠質前體細胞粘附力暫時降低，同時結合短暫機械震蕩方式選擇性分離、純化少突膠質前體細胞。獲得的細胞能夠長期維持增殖能力，保持較高純度，具有分化為成熟少突膠質細胞的能力。

技術領域

本發明屬于生物醫學領域，涉及少突膠質前體細胞的培養，具體涉及一種能夠長期體外培養大鼠少突膠質前體細胞的培養基配方組成以及利用這種培養基進行少突膠質前體細胞的分離、擴增和進一步純化的方法。

背景技術

少突膠質前體細胞在中樞神經系統內發揮著多種重要功能，它們不僅能夠分化為成熟的少突膠質細胞，維持神經纖維電沖動的正常傳導，而且能夠與神經元形成突觸聯系，并且可以產生多種營養因子以支持和保護神經元(Lin SC,Bergles DE.Synapticsignaling between GABAergic interneurons and oligodendrocyte precursor cellsin the hippocampus.Nat Neurosci 2004；7:24-32.)(Lee Y,Morrison BM,Li Y,Lengacher S,Farah MH,Hoffman PN,et al.Oligodendroglia metabolically supportaxons and contribute to neurodegeneration.Nature 2012；487:443-8.)。在體外獲取并純化少突膠質前體細胞進行研究，不僅有助于進一步明確它們在發育和成熟階段的生物學功能與特性，而且也為相關神經疾病如脊髓損傷、多發性硬化等的細胞移植治療研究，提供重要的前提條件和基礎。

目前分離及純化培養少突膠質前體細胞的方法，主要包括混合膠質細胞培養后振搖分離法(McCarthyKD,de Vellis J.Preparation ofseparate astroglial andoligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.J Cell Biol 1980；85:890-902)，免疫吸附純化法(Shi J,MarinovichA,Barres BA.Purification andcharacterization of adult oligodendrocyte precursor cells from the rat opticnerve.J Neurosci1998；18:4627-36.)，神經干細胞定向誘導法(ChenY,BalasubramaniyanV,Peng J,Hurlock EC,Tallquist M,Li J,et al.Isolation and culture ofratandmouse oligodendrocyte precursor cells.Nat Protoc 2007；2:1044-51.)。此外，還有少量文獻報道采用神經母細胞瘤B104的條件培養基來促使原代少突膠質前體細胞增殖并形成克隆球。

混合膠質細胞培養后振搖分離法是獲取大鼠少突膠質前體細胞的最常用方法之一，是通過將新生鼠大腦皮質等處的原代混合膠質細胞在含10～20％胎牛血清的培養基中培養大約7～12天，待膠質細胞分層后，通過恒溫搖床過夜振搖，來促使上層的少突膠質前體細胞脫落；免疫吸附純化法，主要是通過針對少突膠質前體細胞胞膜上的抗原，利用特異性抗體包被的培養皿等來特異性吸附細胞懸液中的少突膠質前體細胞，或通過免疫磁珠、流式細胞儀等儀器方法篩選分離特異性標記的細胞；神經干細胞定向誘導法，是首先將胚胎或新生期的神經組織解離后進行懸浮培養產生神經干細胞克隆，再通過定向誘導的方法如添加血小板源生長因子(Platelet-derived growth factor PDGF)等，使一部分神經干細胞球轉變為少突膠質前體細胞球。