[發(fā)明專利]一種純化培養(yǎng)大鼠少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的培養(yǎng)基及使用方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711038733.4
• 申請(qǐng)日: 2017-10-29
• 公開（公告）號(hào): CN109722416A
• 公開（公告）日: 2019-05-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭華;孫艷;周國民
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/079
• 分類號(hào): C12N5/079
• 代理公司: 上海元一成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

1.一種能夠長期體外培養(yǎng)大鼠少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的培養(yǎng)基配方組成及其應(yīng)用使用方法，其特征在于，通過機(jī)械離解方法制作大鼠大腦皮質(zhì)及脊髓組織細(xì)胞懸液，利用少突膠質(zhì)前體細(xì)胞可在多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)底物上快速貼壁的特點(diǎn)，獲取富含少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的貼壁細(xì)胞；將獲取的貼壁細(xì)胞在含有PDGF、一種嘌呤化合物Purmorphamine、N2添加劑及0.5％胎牛血清的特定培養(yǎng)基中培養(yǎng)，促使貼壁少突膠質(zhì)前體細(xì)胞快速大量增殖；培養(yǎng)5～6天后，將培養(yǎng)基中微量血清短暫撤除2～3天，但仍然保留N2添加劑，PDGF以及Purmorphamine，使少突膠質(zhì)前體細(xì)胞出現(xiàn)可逆性突起回縮、胞體變圓，與底物的粘附性明顯降低，而其它非少突膠質(zhì)前體細(xì)胞仍牢固貼壁；結(jié)合輕柔機(jī)械震蕩方法，使上述少突膠質(zhì)前體細(xì)胞脫壁，從而獲取較高純度的細(xì)胞；獲取的細(xì)胞可在上述培養(yǎng)基中連續(xù)傳代培養(yǎng)數(shù)月，具有連續(xù)增殖能力，以及分化為成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力；

包括步驟：

(1)新生大鼠大腦皮質(zhì)及脊髓組織的獲取和機(jī)械解離：

無菌狀態(tài)下分離新生小鼠大腦皮質(zhì)或脊髓，通過純機(jī)械解離方法制備細(xì)胞懸液并過濾；

(2)細(xì)胞懸液中細(xì)胞的快速短暫粘附：

將細(xì)胞懸液混勻后，置于涂布多聚賴氨酸的細(xì)胞培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板內(nèi)；靜置貼壁10～15分鐘(室溫25℃左右)，靜置過程避免震動(dòng)；靜置結(jié)束后，輕輕傾斜培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板，吸除全部液體；

(3)富含少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)：

將培養(yǎng)基沿著培養(yǎng)瓶壁及板壁輕輕加入，避免對(duì)貼壁細(xì)胞的沖擊；將細(xì)胞置于37℃、5％CO₂條件下靜置培養(yǎng)；培養(yǎng)基每2天完全換液一次，換液前，適度手工搖晃震蕩培養(yǎng)細(xì)胞，促使一些細(xì)胞碎片團(tuán)塊及死亡細(xì)胞脫壁；

(4)利用特定成分短暫撤除方法降低少突膠質(zhì)前體細(xì)胞粘附性

細(xì)胞培養(yǎng)5～6天后，大量少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖；將培養(yǎng)基中0.5％胎牛血清成分撤除后，繼續(xù)培養(yǎng)2～3天后，少突膠質(zhì)前體細(xì)胞出現(xiàn)明顯突起回縮，胞體發(fā)亮變圓，與培養(yǎng)底面的接觸面積明顯變少，易于脫壁；與此同時(shí)，其它非少突膠質(zhì)前體細(xì)胞如星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)無明顯改變；

(5)利用機(jī)械分離方法純化少突膠質(zhì)前體細(xì)胞：

將上述培養(yǎng)細(xì)胞在無菌操作臺(tái)內(nèi)輕輕震蕩敲擊，使大部分少突膠質(zhì)前體細(xì)胞脫壁，絕大部分非少突膠質(zhì)前體細(xì)胞仍牢固貼壁；收集脫壁少突膠質(zhì)前體細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，換為含有0.5％胎牛血清的培養(yǎng)基；

(5)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的長期培養(yǎng)及誘導(dǎo)

細(xì)胞6～8天傳代一次，利用上述短暫血清撤除結(jié)合機(jī)械震蕩方法分離細(xì)胞，按1:2或1:3進(jìn)行傳代；誘導(dǎo)分化時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)基中的PDGF以及嘌呤化合物purmorphamine撤除，添加三碘甲狀腺原氨酸(T3)，繼續(xù)培養(yǎng)5～10天，每3天更換培養(yǎng)基一次，促使細(xì)胞分化成熟。

2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)的純機(jī)械解離方法指通過吸管吹打方式解離組織，不應(yīng)用任何消化酶。

3.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)的快速貼壁是指細(xì)胞懸液在室溫(25℃左右)靜置10～15分鐘。

4.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)的大鼠少突膠質(zhì)前體細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液，其中添加Purmorphamine、0.5％胎牛血清、N2神經(jīng)細(xì)胞生長添加劑和PDGF。

5.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)特定成分短暫撤除是指將培養(yǎng)基中0.5％胎牛血清成分撤除2～3天。