[發(fā)明專利]一種葉酸代謝基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型檢測方法及試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711034501.1
• 申請日: 2017-10-30
• 公開（公告）號: CN107630073A
• 公開（公告）日: 2018-01-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊文輝;詹杜清;方春妮;謝文龍;陳榮山;肖辛野;李奇淵;姚迅
• 申請（專利權(quán)）人: 廈門基源醫(yī)療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因檢測領(lǐng)域，特別涉及一種葉酸代謝基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型檢測方法及試劑盒。

背景技術(shù)

葉酸代謝與人體內(nèi)許多的生化過程密切相關(guān)。一方面作為體內(nèi)生化反應(yīng)中碳單位轉(zhuǎn)移酶系的輔酶，起著碳單位傳遞體的作用，另一方面參與DNA和RNA的合成、蛋白質(zhì)的甲基化，此外也直接影響氨基酸的代謝。參與到葉酸代謝途徑的酶有多種，包括二甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)、甲硫氨酸還原酶(MTR)、甲硫氨酸合成還原酶(MTRR)和胱硫脒β合酶(CBS)等，這些酶的某些核苷酸多態(tài)可導(dǎo)致葉酸代謝異常引起疾病或出生缺陷。

二甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）第677位堿基C>T變異(rs1801133)，可導(dǎo)致MTHFR蛋白第222位的丙氨酸被纈氨酸取代，雜合變異型(677CT)和純合變異型(677TT)，在中國人群中的百分比分別為44％和23％，TT基因型人群高同型半胱氨酸（Hcy）水平顯著升高，大量流行病和臨床研究都證實(shí)TT基因型和高Hcy是腦卒中發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。MTHFR第1298位堿基A>C變異(rs1801131)，可使MTHFR蛋白第433位的谷氨酰胺被丙氨酸取代，雜合變異型(1298AC) 和純合變異型(1298CC)，在中國人群中的百分比分別為29.3％和3.9％，雜合突變型和純合突變型相比野生型，MTHFR酶活性酶活性有所下降，甚至只能達(dá)到野生型的酶活性的30%左右，導(dǎo)致血清葉酸和維生素B12水平下降，血漿中同型半胱氨酸水平升高。甲硫氨酸合成酶還原酶(MTRR)能夠通過還原型甲基化作用重新生成具有功能活性的甲硫氨酸合酶，是葉酸代謝的關(guān)鍵酶之一。主要變異型有十余種，其中A66G是最主要和研究最多的突變。MTRR基因第66位堿基A>G變異(rs1801394)，導(dǎo)致MTRR蛋白氨基酸鏈殘基22位蛋氨酸被異亮氨酸替代，引起酶的活性降低，導(dǎo)致同型半胱氨酸血癥，增加神經(jīng)管畸形和先天性心臟病等出生缺陷性疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。其中雜合變異型(66AG)和純合變異型(66GG)在中國人群中占36％和6％。

葉酸是細(xì)胞生長和組織修復(fù)所必需的物質(zhì)，在胚胎發(fā)育過程中，對孕婦尤其重要。據(jù)我國婚前育齡女性血清抽樣調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國城市和農(nóng)村女性缺乏葉酸者分別有21％和38％。據(jù)衛(wèi)生部及疾控中心相關(guān)報(bào)告，我國每年有90萬新生兒缺陷性疾病誕生，患出生缺陷排在前5位的包括：先天性心臟病，神經(jīng)管畸形，唇腭裂，唐氏綜合征，多指(趾)，這些都與孕婦葉酸缺乏有一定關(guān)系。1997年衛(wèi)生部開始推薦孕期女性統(tǒng)一補(bǔ)充葉酸，劑量為400微克/天，該措施在出生缺陷預(yù)防中起了重要作用。但由于孕婦對葉酸的代謝能力不足，出生缺陷的發(fā)生率仍存在很大的地域差異。對于葉酸代謝能力正常的孕婦來說，每天補(bǔ)充400微克葉酸是足夠的，但是對葉酸代謝能力存在障礙的孕婦來說，應(yīng)該增加補(bǔ)充劑量，對所有成年人包括孕婦和乳母，合成葉酸制劑的可耐受的最高攝入量(UL)設(shè)定為1000微克/天。因此800微克/天的葉酸制劑是安全的。對葉酸的增補(bǔ)劑量并非越多越好。大量研究發(fā)現(xiàn)，過量補(bǔ)充葉酸會(huì)導(dǎo)致以下不良后果：導(dǎo)致體內(nèi)鋅缺乏，孕母葉酸過量補(bǔ)充會(huì)導(dǎo)致胎兒生長緩慢，出生體重過低。近年來的研究表明，葉酸代謝能力在個(gè)體間的差異與部分基因位點(diǎn)的多態(tài)性有關(guān)，具體位點(diǎn)包括：亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因的c.677位點(diǎn)、c.1298位點(diǎn)；甲硫氨酸合成還原酶(MTRR)基因的c.66位點(diǎn)；因此，利用基因分型技術(shù)檢測孕母葉酸代謝相關(guān)基因型，對受檢者葉酸利用能力進(jìn)行分級，進(jìn)而針對性的調(diào)整葉酸補(bǔ)充劑量。

當(dāng)前市場上檢測基因多態(tài)性的方法很多，包括如基因芯片法，基因測序，限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphisms, RFLP）等，其中基因測序?yàn)橥蛔儥z測的金標(biāo)準(zhǔn)，但因其所需時(shí)間長，費(fèi)用高，對取材要求嚴(yán)格，限制了在臨床中的使用。RFLP僅適用于突變位點(diǎn)附近存在適當(dāng)?shù)奶囟ㄏ拗菩詢?nèi)切酶識(shí)別序列的情況，應(yīng)用局限性較大。因此，對于患者而言，快速拿到檢測結(jié)果尤為重要，所以本專利發(fā)明了一種基于實(shí)時(shí)熒光PCR方法，檢測成本很低，從樣本提取到結(jié)果分析，整個(gè)過程可在1小時(shí)之內(nèi)完成，有望在臨床上開展普篩葉酸代謝相關(guān)基因檢測成為可能。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決葉酸代謝多態(tài)性的檢測，本發(fā)明提供一種葉酸代謝基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型檢測方法及試劑盒。