[發明專利]一種葉酸代謝基因多態性位點的基因型檢測方法及試劑盒

在審

• 申請號: 201711034501.1
• 申請日: 2017-10-30
• 公開（公告）號: CN107630073A
• 公開（公告）日: 2018-01-26
• 發明（設計）人: 楊文輝;詹杜清;方春妮;謝文龍;陳榮山;肖辛野;李奇淵;姚迅
• 申請（專利權）人: 廈門基源醫療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司35100
• 代理人: 蔡學俊

1.一種葉酸代謝基因多態性位點的基因型檢測方法，其特征在于：其包括以下步驟：

（1）：DNA提取；

（2）：在相同的反應體系中，使用葉酸代謝基因多態性位點的基因野生型模板的特異性ARMS引物和突變型模板的特異性ARMS引物分別對同一份待測樣本進行實時熒光定量PCR檢測；

所述野生型模板的特異性ARMS引物的3`末端終止在待測位點處并且與野生型序列匹配，其中，在所述引物的3`末端第2-5位設置一個或多個錯配堿基；

所述突變型模板的特異性ARMS引物的3`末端終止在待測位點處并且與突變型序列匹配，其中，在所述引物的3`末端第2-5位設置一個或多個錯配堿基；

所述野生型模板的特異性ARMS引物和所述突變型模板的特異性ARMS引物共用上游或下游引物，所述共用上游或下游引物分別與所述野生型模板的特異性ARMS引物或所述突變型模板的特異性ARMS引物一起擴增一段包含待測基因突變位點的序列；

（3）：根據樣本用野生型模板的特異性ARMS引物進行熒光定量PCR檢測的Ct野生型和突變型模板的特異性ARMS引物進行ARMS熒光定量PCR檢測的Ct突變型，來判斷多態性位點的型別從而確定葉酸代謝基因突變的基因型。

2.根據權利要求1所述的一種葉酸代謝基因多態性位點的基因型檢測方法，其特征在于：DNA提取方法包括如下：

（1）口腔拭子在受檢者口腔左右兩腮分別各上下刮20次，保證采集到足量的口腔脫落細胞樣本，采集完畢，樣本置于樣本保存管，做好標記；

（2）將步驟（1）中的樣本保存管用渦旋振蕩器渦旋混勻30s，使口腔拭子中脫落細胞充分混合至保存液中；

（3）將步驟（2）的保存液全部轉移至新的1.5mL離心管，然后6000g離心2min棄上清，獲得細胞沉淀，此時在管底留10ul保存液，無須完全棄掉；

（4）向步驟（3）獲得細胞沉淀中加入100uL濃度為400mM 的NaOH溶液，渦旋振蕩10s，水浴100℃煮沸裂解6min；

（5）將步驟（4）水浴鍋中的離心管取出，冰上冷卻30s，然后12000g離心1min，取上清液即為提取的口腔拭子基因組DNA。

3. 根據權利要求1所述的一種葉酸代謝基因多態性位點的基因型檢測方法，其特征在于：使用葉酸代謝多態性位點的基因野生型模板的特異性ARMS引物和突變型模板的特異性ARMS引物分別對同一份待測樣本進行實時熒光定量PCR檢測時，為了防止基因組的污染，在反應體系中引入了熱啟動防污染型試劑，包括2U/ul UDG酶和抗體修飾的熱啟動酶。

4.根據權利要求1所述的一種葉酸代謝基因多態性位點的基因型檢測方法，其特征在于：野生型模板的特異性ARMS引物和突變型模板的特異性ARMS引物中，引入錯配堿基的位置和類型相同；除了突變位點處的堿基以外，所述野生型模板的特異性ARMS引物和所述突變型模板的特異性ARMS引物完全相同。

5.根據權利要求1所述的一種葉酸代謝基因多態性位點的基因型檢測方法，其特征在于：所述葉酸代謝多態性位點是MTHFR基因rs1801131：A>C和rs1801133：C>T，MTRR基因rs1801394：A>G。