[發(fā)明專利]一種利用微量神經組織獲取和培養(yǎng)少突膠質前體細胞的方法

在審

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• 申請日: 2017-10-29
• 公開（公告）號: CN109722419A
• 公開（公告）日: 2019-05-07
• 發(fā)明（設計）人: 鄭華;周國民
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N5/0797
• 分類號: C12N5/0797
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學領域，涉及少突膠質前體細胞的獲取方法，具體涉及一種從新生大鼠微量神經組織獲取少突膠質前體細胞并純化培養(yǎng)的方法。本方法通過將微量神經組織用消化酶Accusase進行適度消化并結合機械吹打，離解成單細胞懸液，種植在多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)底面上，添加無血清培養(yǎng)基進行貼壁培養(yǎng)，促使少突膠質前體細胞大量增殖，同時抑制非少突膠質前體細胞過快增殖。培養(yǎng)10天后，撤除培養(yǎng)基中B27添加劑2～3天，使少突膠質前體細胞粘附力暫時降低，通過機械吹打方式進行選擇性分離，獲得進一步純化的大鼠少突膠質前體細胞。獲得的少突膠質前體細胞具有連續(xù)增殖能力，能夠連續(xù)傳代，并具有分化為成熟少突膠質細胞的能力。

技術領域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學領域，涉及少突膠質前體細胞的獲取方法，具體涉及一種從新生大鼠微量神經組織獲取少突膠質前體細胞進行大量增殖并純化培養(yǎng)的方法。

背景技術

少突膠質前體細胞在中樞神經系統(tǒng)內發(fā)揮著多種重要功能，它們不僅能夠分化為成熟的少突膠質細胞，維持神經纖維電沖動的正常傳導，而且能夠與神經元形成突觸聯(lián)系，并且可以產生多種營養(yǎng)因子以支持和保護神經元(Lin SC,Bergles DE.Synapticsignaling between GABAergic interneurons and oligodendrocyte precursor cellsin the hippocampus.Nat Neurosci 2004；7:24-32.)(Lee Y,Morrison BM,Li Y,Lengacher S,Farah MH,Hoffman PN,et al.Oligodendroglia metabolically supportaxons and contribute to neurodegeneration.Nature 2012；487:443-8.)。在體外獲取并純化少突膠質前體細胞進行研究，不僅有助于進一步明確它們在發(fā)育和成熟階段的生物學功能與特性，而且也為相關神經疾病如脊髓損傷、多發(fā)性硬化等的細胞移植治療研究，提供重要的前提條件和基礎。

目前分離及純化培養(yǎng)少突膠質前體細胞的方法，主要包括混合膠質細胞培養(yǎng)后振搖分離法(McCarthyKD,de Vellis J.Preparation of separate astroglial andoligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.J Cell Biol 1980；85:890-902)，免疫吸附純化法(Shi J,MarinovichA,Barres BA.Purification andcharacterization of adult oligodendrocyte precursor cells from the rat opticnerve.J Neurosci 1998；18:4627-36.)，神經干細胞定向誘導法(ChenY,Balasubramaniyan V,Peng J,Hurlock EC,Tallquist M,Li J,et al.Isolation andculture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.Nat Protoc 2007；2:1044-51.)。此外，還有少量文獻報道采用神經母細胞瘤B104的條件培養(yǎng)基來促使原代少突膠質前體細胞增殖并形成克隆球。

混合膠質細胞培養(yǎng)后振搖分離法是獲取大鼠少突膠質前體細胞最常用的方法之一，是通過將新生鼠大腦皮質等處的原代混合細胞在含10～20％胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)大約7～12天，待膠質細胞分層后，通過恒溫搖床過夜振搖，來促使上層的少突膠質前體細胞脫落；免疫吸附純化法，主要是通過針對少突膠質前體細胞胞膜上的抗原，利用特異性抗體包被的培養(yǎng)皿等來特異性吸附細胞懸液中的少突膠質前體細胞，或通過免疫磁珠、流式細胞儀等篩選分離特異性標記的細胞；神經干細胞定向誘導法，是首先將胚胎或新生期的神經組織解離后進行懸浮培養(yǎng)產生神經干細胞克隆，再通過定向誘導的方法如添加血小板源生長因子(Platelet-derived growth factor PDGF)等，使一部分神經干細胞球轉變?yōu)樯偻荒z質前體細胞球。