[發(fā)明專利]一種利用微量神經(jīng)組織獲取和培養(yǎng)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的方法

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• 申請日: 2017-10-29
• 公開（公告）號: CN109722419A
• 公開（公告）日: 2019-05-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭華;周國民
• 申請（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號: C12N5/0797
• 分類號: C12N5/0797
• 代理公司: 上海元一成知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

1.一種從新生大鼠微量神經(jīng)組織獲取少突膠質(zhì)前體細(xì)胞并純化培養(yǎng)的方法，其特征在于，將微量神經(jīng)組織如視神經(jīng)及海馬等用消化酶Accusase進(jìn)行適度消化并結(jié)合機(jī)械吹打，離解成單細(xì)胞懸液后，種植在多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)底面上，添加含有PDGF的無血清培養(yǎng)基進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，特異性地促使少突膠質(zhì)前體細(xì)胞大量增殖，相對抑制非少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的增殖；培養(yǎng)10天后獲得富含少突膠質(zhì)前體細(xì)胞克隆的原代細(xì)胞；隨后暫時撤除培養(yǎng)基中B27添加劑2～3天，利用貼壁少突膠質(zhì)前體細(xì)胞突起暫時回縮、粘附力明顯降低的時機(jī)，結(jié)合人工機(jī)械分離方法，獲得高純度的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞；獲得的大鼠少突膠質(zhì)前體細(xì)胞具有連續(xù)增殖能力，能夠連續(xù)傳代，并具有有分化為成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力；

包括步驟：

(1)新生大鼠微量神經(jīng)組織的獲取、消化和機(jī)械解離

無菌條件下獲取新生SD大鼠眶內(nèi)段視神經(jīng)及海馬等微量神經(jīng)組織，于消化酶Accusase內(nèi)消化60～90分鐘后，經(jīng)機(jī)械吹打解離成細(xì)胞懸液，過濾后種植在多聚賴氨酸涂布的培養(yǎng)板內(nèi)，用含有2％B27添加劑、1％N2添加劑和血小板源生長因子的無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；

(2)原代細(xì)胞培養(yǎng)與少突膠質(zhì)前體細(xì)胞克隆形成

細(xì)胞貼壁培養(yǎng)4天后，出現(xiàn)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖克隆；與此同時，貼壁的其它非少突膠質(zhì)前體細(xì)胞如星形膠質(zhì)細(xì)胞等，增殖速度相對緩慢，培養(yǎng)細(xì)胞中少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的總體比例明顯提高；

(3)利用特定成分短暫撤除方法降低少突膠質(zhì)前體細(xì)胞粘附性

原代細(xì)胞培養(yǎng)10天后，更換為不含B27添加劑的培養(yǎng)基；培養(yǎng)2～3天后，少突膠質(zhì)前體細(xì)胞出現(xiàn)明顯突起回縮，胞體發(fā)亮變圓，與培養(yǎng)底面的接觸面積明顯變少，易于脫壁；與此同時，其它非少突膠質(zhì)前體細(xì)胞如星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)無明顯改變；

(4)利用機(jī)械分離方法純化少突膠質(zhì)前體細(xì)胞

將上述培養(yǎng)細(xì)胞在無菌操作臺內(nèi)輕輕震蕩或吹打，使大部分少突膠質(zhì)前體細(xì)胞脫壁，而絕大部分非少突膠質(zhì)前體細(xì)胞仍牢固貼壁；收集脫壁少突膠質(zhì)前體細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，重新加入2％B27添加劑，并添加堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)；

(5)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的傳代培養(yǎng)以及誘導(dǎo)分化

機(jī)械分離純化的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞在加入2％B27添加劑以及bFGF后，快速貼壁并增殖，細(xì)胞呈典型的雙極或三極形態(tài)，純度達(dá)98％以上；

細(xì)胞傳代：Accusase消化2～3分鐘后用D-PBS清洗，加入完全培養(yǎng)基(含bFGF)吹打使細(xì)胞脫壁，收集細(xì)胞按1:2或1:3比例傳代；

細(xì)胞分化：將細(xì)胞培養(yǎng)基中的PDGF及bFGF撤除，添加15nm的三碘甲狀腺原氨酸(T3)，繼續(xù)培養(yǎng)5-10天，每3天更換培養(yǎng)基一次。

2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)的消化方法指將視神經(jīng)及海馬等微量神經(jīng)組織置于消化酶Accusase內(nèi)消化30～90分鐘，不再使用其它類型消化酶。

3.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)的大鼠少突膠質(zhì)前體細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液，其中添加有B27、N2和血小板源生長因子。

4.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)特定成分短暫撤除是指撤除B27添加劑2～3天。