[發明專利]一種誘導大鼠骨髓間充質干細胞分化成破骨樣細胞的方法

在審

• 申請號: 201711029436.3
• 申請日: 2017-10-20
• 公開（公告）號: CN109694850A
• 公開（公告）日: 2019-04-30
• 發明（設計）人: 許健;楊亞洋;沈雯;任軍;許斌;姚葉濤;沈燦
• 申請（專利權）人: 許健;楊亞洋;沈雯
• 主分類號: C12N5/078
• 分類號: C12N5/078;C12N5/0775
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種誘導大鼠骨髓間充質干細胞分化成破骨樣細胞的方法，其特征在于：在大鼠骨髓間充質干細胞培養基中添加硫代乙酰胺(Thioacetamide，TAA)，利用硫代乙酰胺作用于培養的大鼠骨髓間充質干細胞，誘導其定向分化為破骨樣細胞。

2.根據權利要求1中的方法，其特征在于，大鼠骨髓間充質干細胞的制備：無菌條件下分離出大鼠乳鼠雙下肢股骨，用含體積分數10％胎牛血清的DMEM/F12培養液沖洗骨髓腔，收集單細胞懸液，離心，棄上清液，用10％胎牛血清的DMEM/F12培養液重懸，取約5×10³個細胞接種在培養瓶中，置于37℃、體積分數5％CO₂的培養箱中培養，48h后首次全量換液，以后每2至3天換液，10至12天后細胞融合70％～80％，0.25％胰酶消化后以1∶3傳代培養。

3.根據權利要求1至2的方法，其特征在于，制備的大鼠骨髓間充質干細胞的鑒定方法，即采用流式細胞法檢測骨髓間充質干細胞表面陽性標志物CD90和CD29，采用流式細胞法檢測骨髓間充質干細胞表面陰性標志物CD45和CD11b/c，所使用的為第3代大鼠骨髓間充質干細胞，且陽性細胞比例≥95％，陰性細胞比例＜6％。

4.根據權利要求1至3的方法，其特征在于，誘導大鼠骨髓間充質干細胞分化成破骨樣細胞的誘導培養基中所含的水溶性硫代乙酰胺(TAA)含量為0.5mg/ml和1.0mg/ml，基礎培養基為DMEM/F12培養液，同時添加體積分數為10％的胎牛血清。

5.根據權利要求1至4的方法，其特征在于，誘導大鼠骨髓間充質干細胞分化成破骨樣細胞方法中大鼠骨髓間充質干細胞為第3代大鼠骨髓間充質干細胞，誘導培養基誘導大鼠骨髓間充質干細胞分化成破骨樣細胞的時間為3天和7天。

6.根據權利要求1至5的方法，其特征在于，水溶性硫代乙酰胺(TAA)誘導大鼠骨髓間充質干細胞分化成的破骨樣細胞的鑒定方法，即抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)法鑒定破骨樣細胞、Western blot法鑒定破骨細胞特異性蛋白抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和組織蛋白酶K(Cathepsin K)蛋白表達以及電化學發光法檢測骨代謝標志物：N端骨鈣素(ng/ml)，甲狀旁腺激素(pg/ml)，維生素D(ng/ml)。

7.根據權利要求1至6的方法，其特征在于，水溶性硫代乙酰胺(TAA)誘導大鼠骨髓間充質干細胞分化成的破骨樣細胞的鑒定結果：抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)法鑒定結果顯示，誘導組可以觀察到更多的trap染色陽性細胞，即破骨樣細胞，細胞體積更大，可看到多于3個細胞核的細胞；Western Blot法鑒定結果顯示，破骨細胞特異性蛋白抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和組織蛋白酶K(Cathepsin K)蛋白表達水平呈上升趨勢，說明破骨細胞生成量增加；電化學發光法檢測骨代謝標志物鑒定結果顯示，溶骨相關和骨轉換相關骨標志物水平的變化說明破骨細胞活性增強。

8.根據權利要求1至7的方法，其所訴的誘導破骨樣細胞形成方法用于在提高大鼠骨髓間充質干細胞向破骨樣細胞分化方面的應用。

9.根據權利要求1至7的方法，其所訴的誘導破骨樣細胞形成方法用于在建立一種新型體外破骨細胞培養體系方面的應用。

10.根據權利要求1至7的方法，其所訴的誘導破骨樣細胞形成方法用于在建立骨與關節病變細胞模型方面的應用。

11.根據權利要求1至7的方法，其所訴的誘導破骨樣細胞形成方法用于在建立抗骨質疏松癥藥物篩選平臺方面的應用。

12.根據權利要求1至7的方法，其所訴的誘導破骨樣細胞形成方法用于在建立抗骨質破壞癥藥物篩選平臺方面的應用。