[發(fā)明專利]一種在單分子水平同時檢測多種DNA糖基化酶的熒光化學傳感器及其檢測方法和應用

有效

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• 申請日: 2017-10-27
• 公開（公告）號: CN107723338B
• 公開（公告）日: 2020-03-27
• 發(fā)明（設計）人: 張春陽;胡娟;劉明昊
• 申請（專利權）人: 山東師范大學
• 主分類號: C12Q1/44
• 分類號: C12Q1/44;C12Q1/34;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 王志坤

本發(fā)明公開了一種在單分子水平同時檢測多種DNA糖基化酶的熒光化學傳感器及其檢測方法和應用，該傳感器基于修飾有8?羥基鳥嘌呤且尾端標記花菁3(Cy3)和猝滅基團的分子信標以及修飾有脫氧次黃嘌呤且尾端標記花菁5(Cy5)和猝滅基團的兩種不同的分子信標用于檢測8?羥基鳥嘌呤DNA糖基化酶和N?甲基嘌呤DNA糖基化酶，與受動力學和熱力學影響嚴重的傳統(tǒng)分子信標不同，Cy3和Cy5的信號恢復取決于DNA糖基化酶為媒介的分子信標劈裂，該方法在不涉及任何信號擴增的情況下能夠實現(xiàn)同時靈敏檢測對hOGG1和hAAG活性的超靈敏檢測，操作簡便、快速，試驗結果準確、可靠。

技術領域

本發(fā)明屬于生物分析技術領域，具體涉及基于一種在單分子水平同時檢測多種DNA糖基化酶的熒光化學傳感器及其檢測方法和應用。

背景技術

DNA糖基化酶是一種堿基切除修復路徑中的初始酶，此種酶能夠識別并切除變異的DNA堿基并產生無嘌呤或者無嘧啶(AP)位點，DNA糖基化酶的正常活動保證了堿基切除修復的穩(wěn)定性從而保證基因組的穩(wěn)定性。堿基切除修復路徑至少涉及11種不同的哺乳動物糖基化酶，這些酶通過依賴不同的變異類型發(fā)生作用。此外，異常的DNA糖基化酶和癌癥，神經病，心血管疾病和炎癥等一系列疾病密切相關。

檢測糖基化酶的傳統(tǒng)方法包括放射性標記法，酶連免疫吸附測定，高相液相色譜法，以磁珠納米顆粒為基礎的分離法，以金納米顆粒為基礎的比色法。放射性標記法將待檢測物標記一種或兩種放射性核素從而用于檢測。酶連免疫吸附測定(ELISA)基于酶分子與抗體或者抗抗體分子的共價結合，通過ELISA 檢測儀進行測定從而判斷有無相應的反應。高相液相色譜法(HPLC)以液體為流動相，向色譜柱內加入不同的洗脫液從而在柱內將各種成分分離，進入檢測器進行檢測。磁珠納米顆粒為基礎的分離法以修飾DNA為發(fā)卡探針連接磁珠與熒光基團實現(xiàn)熒光猝滅，通過糖基化酶引發(fā)的發(fā)卡探針劈裂并分離磁珠實現(xiàn)熒光基團的釋放從而獲得信號。以納米金顆粒為基礎的比色法通過使分散狀態(tài)的納米金顆粒團聚，使納米金溶液的顏色發(fā)生改變，并通過紫外分光光度計檢測納米金溶液在520nm和650nm波長處的紫外吸收峰。

然而這些傳統(tǒng)的檢測方法需要昂貴的標記試劑，所需DNA片段過于冗長，檢測設備過于昂貴，這些均增加了實驗成本并且上述方法步驟繁瑣，分析時間長，特異性及靈敏度較差。

為了提高檢測靈敏度，人們在糖基化酶檢測中引入了一些擴增步驟，如核酸外切酶(λ核酸外切酶或核酸外切酶III)輔助的信號擴增，目標介導的自動催化生成DNA核酶的滾環(huán)擴增和低變性溫度聚合酶鏈反應擴增。這些方法通過擴增進行信號放大提高了檢測靈敏度，但外切酶輔助的信號擴增對反應體系要求較高，重現(xiàn)性差。而目標介導的自動催化生成DNA核酶的滾環(huán)擴增易發(fā)生非特異性擴增，產生假陽性信號，降低特異性。同時低變性溫度聚合酶鏈反應依賴高精度的溫度循環(huán)，多種引物和特定的DNA聚合酶，增加檢測的復雜性和花費。此外，上述這些擴增放大信號的方法僅僅能夠用于測量一種DNA 糖基化酶。因此開發(fā)一種簡單靈敏廉價且能夠同時檢測多種DNA糖基化酶的方法成為本領域研究人員亟待解決的問題。

發(fā)明內容

針對上述現(xiàn)有技術的不足，發(fā)明人經長期的技術與實踐探索，提供一種同時檢測8-羥基鳥嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)和N-甲基嘌呤DNA糖基化酶 (hAAG)的熒光化學傳感器，該傳感器基于修飾有8-羥基鳥嘌呤且尾端標記花菁 3(Cy3)和猝滅基團的分子信標以及修飾有脫氧次黃嘌呤且尾端標記花菁5(Cy5) 和猝滅基團的兩種不同的分子信標用于檢測hOGG1和hAAG，與受動力學和熱力學影響嚴重的傳統(tǒng)分子信標不同，Cy3和Cy5的信號恢復取決于DNA糖基化酶為媒介的分子信標劈裂，該方法在不涉及任何信號擴增的情況下能夠實現(xiàn)同時靈敏檢測對hOGG1和hAAG活性的超靈敏檢測，操作簡便、快速，試驗結果準確、可靠。

具體的，本發(fā)明涉及以下技術方案：

本發(fā)明的第一個方面，提供了一種同時檢測hOGG1和hAAG的熒光化學傳感器，所述熒光化學傳感器包括：hOGG1分子信標和hAAG分子信標；