[發(fā)明專利]樹突狀細胞子集CD103+DC的體外培養(yǎng)方法及鑒定方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711027587.5
• 申請日: 2017-10-27
• 公開（公告）號: CN107841486A
• 公開（公告）日: 2018-03-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李建喜;張景艷;張凱;侯艷華;王磊;王學(xué)智;張康;王旭榮
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所
• 主分類號: C12N5/0784
• 分類號: C12N5/0784;G01N23/2251;G01N21/64;G01N15/14
• 代理公司: 北京中恒高博知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11249
• 代理人: 姜司晨

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細胞體外培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及樹突狀細胞子集CD103⁺DC的體外培養(yǎng)方法及鑒定方法。

背景技術(shù)

樹突狀細胞(Dendritic cells，DCs)是目前所知功能最強的專職抗原提呈細胞，能高效地攝取、加工和提呈抗原。未成熟的DC具有較強的遷移能力，成熟的DC表面會形成樹突樣結(jié)構(gòu)，它可刺激幼稚T細胞和B細胞的分化，在調(diào)節(jié)天然免疫與獲得性免疫維持機體穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用。自加拿大學(xué)者Steinman于1973年發(fā)現(xiàn)樹突狀細胞以來，它的生物學(xué)活性作用一直是人們研究的熱點，目前實驗研究主要靠自主分離培養(yǎng)為主，成熟穩(wěn)定的分離培養(yǎng)方法顯得尤其重要。根據(jù)DCs表面分子表達情況可將其分為不同的子集，CD103⁺DC是其中一個重要的子集，是能夠表達整合素分子αEβ7的α鏈CD103分子的樹突狀細胞。腸道CD103⁺DC不僅可以誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞(T regulatory cells,treg)的產(chǎn)生，而且可以指導(dǎo)T細胞表面歸巢分子CCR9和α4β7的表達。研究發(fā)現(xiàn)，當機體處于穩(wěn)態(tài)時，小腸固有層(Lamina propia,LP)中的CD103⁺DC主要誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞的形成和T細胞的歸巢，從而啟動免疫耐受。在視黃酸(RA)和TGF-β的作用下，LP中CD103⁺DC可誘導(dǎo)腸粘膜調(diào)節(jié)性T細胞CD4⁺Foxp3⁺Treg的產(chǎn)生；在腸系膜淋巴結(jié)(Mesenteric lymph nodes，MLN)中，遷移性CD103⁺DC不僅可影響腸道T細胞和B細胞表面歸巢分子的表達，而且能夠誘導(dǎo)Foxp3⁺Treg的產(chǎn)生，Annacker等研究表明當存在CD103⁺DC時，Treg細胞可抑制T細胞介導(dǎo)的結(jié)腸炎。當機體處于病理狀態(tài)時，腸道上皮發(fā)生炎性浸潤時，CD103⁺DC能夠?qū)⑼挥|伸入腸腔捕獲抗原，攜帶抗原的CD103⁺DC在CCR7介導(dǎo)下進入腸系膜淋巴結(jié)，在TLR配體的刺激下CD103⁺DC能分泌IL-6，進而誘導(dǎo)TH17的分化，參與固有免疫反應(yīng)和某些炎性反應(yīng)。Schlitzer等人研究發(fā)現(xiàn)，選擇性CD103⁺DC缺陷小鼠腸道MLN缺乏內(nèi)源性TH17細胞。劉頌利用STING基因敲除小鼠證明，CD103⁺cDC內(nèi)的STING能夠識別細菌釋放的c-di-GMP，進而介導(dǎo)腸粘膜TH17應(yīng)答，抑制Treg分化。由此可見，CD103⁺DC在維持腸黏膜免疫與免疫耐受平衡中起著重要作用，建立一種CD103⁺DC穩(wěn)定的體外培養(yǎng)方法，對研究CD103⁺DC起源、生物學(xué)特征、治療應(yīng)用具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是針對上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供了樹突狀細胞子集CD103⁺DC的體外培養(yǎng)方法及鑒定方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：樹突狀細胞子集CD103⁺DC的體外培養(yǎng)方法，所述樹突狀細胞子集CD103⁺DC為小鼠骨髓源CD103⁺DC，體外培養(yǎng)方法包括以下步驟：

1)配制完全培養(yǎng)基：

完全培養(yǎng)基是由含有FLT3L、GM-CSF、FBS和雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基配制而成，其中FLT3L的含量為200ng/mL，GM-CSF的含量為10ng/mL，F(xiàn)BS的含量按照質(zhì)量百分比計為10％，雙抗的含量按照質(zhì)量百分比計為1％；

2)小鼠骨髓源細胞的培養(yǎng)：

取6-8周齡C57BL/6小鼠，脫頸處死，置于75％酒精中浸泡30min；用DPBS沖洗小鼠脛骨、腓骨腔以獲得骨髓源細胞，獲得的骨髓源細胞以離心力300g離心5min，棄上清；加入3倍體積的紅細胞裂解液作用2min，以離心力300g離心5min，棄上清；加入DPBS懸浮細胞，用細胞篩過濾，濾液以離心力300g離心5min，棄上清；加入完全培養(yǎng)基懸浮細胞，使細胞濃度最終為1.5×10⁷個/mL，移至6孔板中培養(yǎng)；培養(yǎng)至第5d，每孔加入1/2體積(移至6孔板中的細胞培養(yǎng)液的1/2)的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；于第9d收集細胞，以離心力300g離心5min；加入完全培養(yǎng)基重懸，繼續(xù)培養(yǎng)至第15d，收獲細胞。