[發明專利]樹突狀細胞子集CD103+DC的體外培養方法及鑒定方法

在審

• 申請號: 201711027587.5
• 申請日: 2017-10-27
• 公開（公告）號: CN107841486A
• 公開（公告）日: 2018-03-27
• 發明（設計）人: 李建喜;張景艷;張凱;侯艷華;王磊;王學智;張康;王旭榮
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所
• 主分類號: C12N5/0784
• 分類號: C12N5/0784;G01N23/2251;G01N21/64;G01N15/14
• 代理公司: 北京中恒高博知識產權代理有限公司11249
• 代理人: 姜司晨

1.樹突狀細胞子集CD103⁺DC的體外培養方法，其特征在于，所述樹突狀細胞子集CD103⁺DC為小鼠骨髓源CD103⁺DC，體外培養方法包括以下步驟：

1)配制完全培養基：

完全培養基是由含有FLT3L、GM-CSF、FBS和雙抗的RPMI-1640培養基配制而成，其中FLT3L的含量為200ng/mL，GM-CSF的含量為10ng/mL，FBS的含量按照質量百分比計為10％，雙抗的含量按照質量百分比計為1％；

2)小鼠骨髓源細胞的培養：

取6-8周齡C57BL/6小鼠，脫頸處死，置于75％酒精中浸泡30min；用DPBS沖洗小鼠脛骨、腓骨腔以獲得骨髓源細胞，獲得的骨髓源細胞以離心力300g離心5min，棄上清；加入3倍體積的紅細胞裂解液作用2min，以離心力300g離心5min，棄上清；加入DPBS懸浮細胞，用細胞篩過濾，濾液以離心力300g離心5min，棄上清；加入一定體積的完全培養基懸浮細胞，使細胞濃度最終為1.5×10⁷個/mL，并移至6孔板中培養；培養至第5d，每孔加入1/2體積的完全培養基，繼續培養；于第9d收集細胞，以離心力300g離心5min；加入完全培養基重懸，繼續培養至第15d，收獲細胞。

2.根據權利要求1所述的樹突狀細胞子集CD103⁺DC的體外培養方法培養得到的小鼠骨髓源樹突狀細胞子集CD103⁺DC。

3.根據權利要求2所述的小鼠骨髓源樹突狀細胞子集CD103⁺DC的鑒定方法，其特征在于，是在骨髓源細胞培養至第15d時，分別進行噴晶掃描電鏡觀察和熒光顯微鏡觀察；在骨髓源細胞培養至第16d時，進行流式細胞術鑒定。

4.根據權利要求3所述的鑒定方法，其特征在于，所述噴晶掃描電鏡觀察過程為：將培養至第15d的骨髓源細胞，加100ng/mL LPS處理24h；收集細胞至15mL離心管，以離心力300g離心5min；將細胞用完全培養基重懸，轉入放置多聚賴氨酸包被無菌蓋玻片的48孔細胞培養板中，培養24h后見部分細胞貼壁，棄去細胞懸液；用DPBS清洗3次，每次5min；2.5％的戊二醛4℃固定1h；棄去戊二醛，DPBS清洗3次；依次用30％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、100％的乙醇逐級脫水，自然干燥；取出蓋玻片，噴晶掃描電鏡觀察。

5.根據權利要求3所述的鑒定方法，其特征在于，所述熒光顯微鏡觀察過程為：將培養至第15d的骨髓源細胞，加100ng/mL LPS處理24h；收集細胞至15mL離心管，以離心力300g離心5min；將細胞用完全培養基重懸，轉入放置多聚賴氨酸包被無菌蓋玻片的6孔細胞培養板中，培養24h后見部分細胞貼壁，棄去細胞懸液；用DPBS清洗3次，每次5min；4％多聚甲醛室溫下固定20min，DPBS清洗3次；0.2％Triton-100通透15min，DPBS清洗3次；5％BSA于4℃下包被30min，DPBS清洗3次；按體積比1：100比例加入Anti-Mouse CD103一抗，37℃溫箱孵育2h，DPBS清洗3次；按體積比1：100比例加入Antibody To Rabbit IgG(H+L)二抗，37℃溫箱避光孵育1h，DPBS清洗3次；加入10μL DAPI，室溫下孵育10min，DPBS清洗3次；取出蓋玻片，用熒光淬滅劑封片；熒光顯微鏡觀察。

6.根據權利要求3所述的鑒定方法，其特征在于，流式細胞術鑒定過程為：收集培養至16d的骨髓源細胞至15mL離心管，以離心力300g離心5min，棄上清，DPBS清洗2次；用DPBS將細胞濃度調整至1×10⁶個/mL；分別取1mL細胞懸液轉入2個1.5mL的EP管中，其中1管加入5μL的Anti-Mouse CD103-PE，另1管加入同型對照倉鼠IgG-PE，37℃避光孵育30min；以離心力300g離心5min；棄上清，DPBS清洗兩次；分別加入500μLDPBS重懸細胞，過膜并轉移至專用檢測管，流式細胞儀檢測。