[發明專利]一種鑒別泰國多鱗鱚隱存種與多鱗鱚的分子標記、引物及方法

在審

• 申請號: 201711024496.6
• 申請日: 2017-10-26
• 公開（公告）號: CN107604079A
• 公開（公告）日: 2018-01-19
• 發明（設計）人: 高天翔;肖家光;楊天燕;陳治;張秀梅
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙)33213
• 代理人: 吳秉中

技術領域

本發明屬于分子生物技術領域，具體涉及一種鑒別泰國多鱗鱚隱存種與多鱗鱚的分子標記、引物及方法。

背景技術

泰國多鱗鱚隱存種發現于泰國普吉島近海，隸屬于鱸形目、鱸亞目、鱚科、鱚屬。其外部形態與多鱗鱚極為相似：體呈長圓柱形，略側扁，口小，開于吻端，上下頜骨和犁骨具帶狀細齒，但口蓋骨、腭骨及舌上均無齒。主鰓蓋骨小，有一短棘；前鰓蓋骨后緣垂直，平滑或略有鋸齒，下緣水平。體被小形櫛鱗；頰部具鱗2~3列，皆為圓鱗；側線完全，一條，略彎曲。第一背鰭具XI硬棘，第二背鰭具I硬棘及21~22軟條，臀鰭具II硬棘及21~22軟條，具69~72側線鱗；脊椎骨數34。體背部青灰色，頭部背側深色，腹側白色；體側側線下部時有由黑色小點組成的模糊條帶。第一及第二背鰭淡黃色，密布黑色小點；腹鰭和臀鰭黃白色，臀鰭帶黑點；尾叉淺，近截形；尾鰭深褐色至深灰色。目前還未有用于鑒定該多鱗鱚隱存種的方法，該種的其它研究也未見報道。由于二者形態非常相似，僅憑借形態特征很難將兩者區分。因此尋找區分該多鱗鱚隱存種和多鱗鱚的可靠標準，從混雜的種質中鑒別、分離種質成為一個迫不及待的問題。這將有助于解決種質混雜等問題，為種質保護、合理利用以及種質的生物多樣性研究提供技術支撐。

線粒體DNA控制區（又稱D-環區，displacement loop region）是線粒體DNA中的一段非編碼區，它位于t RNA-Pro和t RNA-Phe之間，是整個mt DNA基因組序列堿基組成和長度變異最大的區域。由于受到選擇壓力較小，因此積累了較多的突變，如堿基替換、插入、缺失，以及眾多的串聯重復序列而形成了多態性。因而理論上，線粒體控制區是突變速率最快的序列。被廣泛用于群體遺傳結構、魚類遺傳多樣性的變異分析。

發明內容

本發明的目的在于提供一種能夠準確高效地鑒別泰國多鱗鱚隱存種和多鱗鱚，引物長度適當，與模板的序列緊密互補，鑒別方法簡單，易于掌握，準確性高，鑒定結果穩定，可重復性強的鑒別泰國多鱗鱚隱存種與多鱗鱚的分子標記、引物及方法。

本發明針對上述技術中提到的問題，采取的技術方案為：

一種鑒別泰國多鱗鱚隱存種與多鱗鱚的分子標記，具體標記序列為：

泰國多鱗鱚隱存種的分子標記序列為：

CCCATGCAGGTGCTTCCGTTGACCTCACTATCTTCTCCCTGCACTTAGCAGGGATTTCATCAATTCTAGGGGCAATCAACTTCATCACGACAATCATTAACATGAAACCTCCTGCAACTTCCCAATACCAAACCCCACTGTTTGTATGGTCCGTCTTAATTACGGCTGTTCTCCTCCTCCTTTCACTCCCCGTACTCGCAGCCGGAATCACCATGCTTCTCACAGATCGAAACCTGAACACCACC；

多鱗鱚的分子標記序列為：

CCCATGCAGGAGCTTCCGTTGACCTTACTATCTTCTCCCTGCACTTAGCAGGGATTTCATCAATTTTAGGAGCAATCAACTTTATCACAACAATCATTAACATGAAACCTCCTGCAACTTCCCAGTACCAAACCCCACTGTTTGTATGGTCCGTCTTAATTACAGCTGTTCTCCTCCTCCTTTCACTGCCTGTACTCGCAGCCGGAATCACCATGCTTCTCACAGATCGAAATCTGAACACCACC。上述多鱗鱚隱存種和多鱗鱚存在11個堿基的差異，表現為9個顛換，2個轉換，表現為32個顛換，6個轉換。其結果穩定，可重復性強，能夠準確高效低鑒別泰國多鱗鱚隱存種與多鱗鱚。

一種鑒別泰國多鱗鱚隱存種與多鱗鱚的分子標記引物，引物序列為：

L6312：5’-TCCTCTAGCAGGCAACTTAG-3’；

H6558：5’-CCTCCTGCAGGGTCAAAGAA-3’。上述引物長度適當，與模板的序列緊密互補，引物與引物之間難以形成穩定的二聚體和發夾結構，在錯配位點的引發效率極低，其自身不存在互補序列，自身難以形成發夾結構，與模板的序列能夠緊密互補，且延伸溫度小于74℃，有利于擴增反應的進行。

一種鑒別泰國多鱗鱚隱存種與多鱗鱚的分子標記方法，具體步驟為：