[發明專利]一種抑制外顯子剪切抑制子功能的反義寡核苷酸的篩選方法

有效

• 申請號: 201711020669.7
• 申請日: 2017-10-26
• 公開（公告）號: CN108265053B
• 公開（公告）日: 2020-10-13
• 發明（設計）人: 賈榮;郭繼華;車曉軒
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12Q1/6858
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 彭勁松

本發明公開了一種抑制外顯子剪切抑制子功能的反義寡核苷酸的篩選方法。包括如下步驟：1）獲得靶基因的外顯子剪切抑制子和臨近的基因序列。2）根據序列設計和合成一系列經硫代修飾的反義寡核苷酸。3）將反義寡核苷酸轉染到細胞中，并在24小時后提取總蛋白。用western雜交法確定與靶基因外顯子剪切抑制子結合效果最好的反義寡核苷酸。4）根據步驟3）獲得的反義寡核苷酸的序列，合成2'?O?Methyl和硫代修飾的反義寡核苷酸，并轉染細胞，用RT?PCR的方法確定其可以高效地抑制外顯子剪切抑制子功能。該方法適用于經濟地篩選可以高效地抑制外顯子剪切抑制子功能的反義寡核苷酸，具有良好的開發和應用前景。

技術領域

本發明屬于生物技術和醫學領域。具體涉及一種抑制外顯子剪切抑制子功能的反義寡核苷酸的篩選方法。

背景技術

真核細胞的基因包含了外顯子(exon)和內含子(intron)。當基因表達的時候，先由RNA聚合酶根據基因的DNA模板合成前體信使RNA(mRNA)。前體mRNA包括外顯子和內含子。然后由剪切復合體(spliceosome)將內含子去除并將外顯子連接，形成成熟的mRNA，可以指導蛋白質的合成。然而，前體mRNA的剪切并不是一成不變的，比如：有些外顯子可能在剪切時被排除在成熟的mRNA中，稱為外顯子跳躍(exon skipping)，有些內含子被保留在成熟的mRNA中，稱為內含子保留(intron retention)，可以看出，同一個基因轉錄后通過可變剪切可以產生多種mRNA，由于所包含的部分序列的改變，它們所編碼的蛋白質也是不同的。這些前體mRNA的多種剪切方式被稱為可變剪切(alternative splicing)。目前發現超過90％的人類基因的前體mRNA都有可變剪切的現象。有些基因的可變剪切方式眾多，所產生的mRNA的種類成百上千，極大地豐富了基因組的編碼能力。

目前的研究發現可變剪切與疾病的發生發展有密切的關系。比如癌癥細胞的基因的可變剪切方式與正常細胞有很大的區別¹。與癌癥相關的基因發生可變剪切后往往會產生兩種主要的結果；所編碼的蛋白或促進或抑制癌癥的發生發展。癌細胞中癌癥相關基因的可變剪切主要是產生可以編碼促進癌癥發生發展的mRNA。因此通過調控可變剪切，抑制促進癌癥發生發展的mRNA產生可以起到抑制癌癥的作用。目前調控可變剪切的方法主要是通過反義寡核苷酸結合到外顯子與內含子的結合點，抑制剪切復合體識別剪切位點，從而阻止外顯子的剪切并被排除在成熟mRNA外²。

前體mRNA可變剪切的調控主要是通過可變剪切調控因子與前體mRNA外顯子或內含子上的調控元件相互作用，比如外顯子的剪切增強子(exonic splice enhancer，ESE)或抑制子(exonic splice suppressor或exonic splice silencer，ESS)。外顯子剪切抑制子的功能主要是抑制外顯子的剪切，使其不能包含在成熟mRNA中。有一些疾病與外顯子剪切抑制子的作用有關。比如脊髓型肌萎縮癥(SMA)病人往往有SMN2基因的第7個外顯子上一個外顯子抑制子的突變，導致第7個外顯子的跳過丟失和所編碼的蛋白功能的缺失。利用反義寡核苷酸結合在外顯子抑制子上可以影響其功能，增加外顯子7的剪切，增加SMN2蛋白的表達，從而起治療作用³。