[發(fā)明專利]快速檢測呼吸道B、C、E種人腺病毒DNA的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201711018984.6
• 申請日: 2017-10-27
• 公開（公告）號: CN108251556A
• 公開（公告）日: 2018-07-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉和錄;竇宇紅;杜紀(jì)坤;朱惠君;李玉霞;劉瓊;馬彩鳳
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市寶安區(qū)沙井人民醫(yī)院;劉和錄
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12Q1/6806;C12R1/93
• 代理公司: 北京匯捷知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11531
• 代理人: 于鵬

1.一種快速檢測呼吸道B、C、E種人腺病毒DNA的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)臨床呼吸道樣本采集和選取

咽拭子樣本采用一次性咽拭子刷取鼻咽部上皮細(xì)胞，洗脫于1.0ml樣本保存液中備用，共收集臨床樣本若干份；

(2)人腺病毒核酸提取與純化

采用商品化磁珠法咽拭子核酸提取試劑盒提取和純化所有樣本人腺病毒核酸，所有操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行；

(3)人腺病毒核酸篩查

采用兩種商品化人腺病毒核酸檢測試劑盒篩查所有樣本人腺病毒核酸，所有操作和結(jié)果判斷嚴(yán)格按說明書進(jìn)行；

(4)質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒構(gòu)建

用軟件生成一段1000bp隨機(jī)DNA序列，其中A、T、C、G四種堿基各占25％，插入PBSK載體構(gòu)建質(zhì)粒并提取質(zhì)粒核酸；

(5)B、C、E種人腺病毒DNA 4重qPCR引物、探針設(shè)計(jì)與合成標(biāo)記

從數(shù)據(jù)庫中，分別下載B、C、E種人腺病毒E3基因序列，用軟件分別比對B、C、E種人腺病毒E3基因序列，找出各種人腺病毒的保守區(qū)；根據(jù)比對結(jié)果避開變異區(qū)或突變點(diǎn)后，用Primer 5分別設(shè)計(jì)B、C、E種人腺病毒E3基因及質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒引物和探針；

(6)4重qPCR體系優(yōu)化、擴(kuò)增及結(jié)果判斷

優(yōu)化4重qPCR反應(yīng)體系，化學(xué)修飾熱啟動DNA聚合酶，加無菌雙蒸水；qPCR擴(kuò)增兩步法，選擇FAM、VIC、ROX、CY5，4通道于退火階段探測熒光，以擴(kuò)增曲線呈“S”形，CT值≤35，擴(kuò)增曲線與基線夾角≥30°判為陽性，否則判為陰性；

(7)PCR產(chǎn)物測序：人腺病毒核酸篩查陽性的PCR產(chǎn)物采用克隆測序，PCR產(chǎn)物測序采用上下游引物雙向測序；

(8)檢測下限與定量范圍試驗(yàn)

取2、3、4型人腺病毒培養(yǎng)液提取病毒核酸，用數(shù)字PCR系統(tǒng)定量后，將病毒核酸調(diào)成約1.0×108Copies/ml，10倍連續(xù)稀釋成7個(gè)梯度濃度，按步驟(6)所述方法和標(biāo)準(zhǔn)上機(jī)擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)，以能判陽的最低加入模板數(shù)作為檢測下限；以擴(kuò)增效率在0.95～1.05、相關(guān)系數(shù)>0.98、截距在3.1～3.5的最大與最小稀釋度作為定量范圍；

(9)真陽性、假陽性、真陰性、假陰性判斷

真陽性：經(jīng)測序比對后，與人腺病毒同源性≥70％；假陽性：經(jīng)測序比對后，與人腺病毒同源性<70％；真陰性：①本方法及人腺病毒核酸篩查均陰性；②本方法陰性，人腺病毒核酸篩查陽性，經(jīng)測序比對后，與人腺病毒同源性<70％；假陰性：人腺病毒核酸篩查陽性，經(jīng)測序比對后，與人腺病毒同源性≥70％；

(10)試劑指標(biāo)計(jì)算：

靈敏度計(jì)算：靈敏度＝真陽性數(shù)÷(真陽性數(shù)+假陰性)×100％；

特異性計(jì)算：特異性＝真陰性數(shù)÷(真陰性數(shù)+假陽性)×100％；

漏診率計(jì)算：漏診率＝(1-靈敏度)×100％；

誤診率計(jì)算：誤診率＝(1-特異性)×100％；

符合率計(jì)算：符合率＝(真陽性數(shù)+真陰性數(shù))÷檢測總數(shù)×100％。