[發明專利]一種Aβ42修飾蛋白及其表達與純化方法

有效

• 申請號: 201711018671.0
• 申請日: 2017-10-27
• 公開（公告）號: CN107746432B
• 公開（公告）日: 2020-05-12
• 發明（設計）人: 劉夫鋒;賈龍剛;路福平;王文娟;李玉;張會圖
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;C07K1/22;C12N15/62;C12N15/70;G01N33/68
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

本發明屬于生物技術和基因工程技術領域，具體涉及一種Aβ42修飾蛋白及其在大腸桿菌中的表達及純化方法。本發明構建的Aβ42表達體系提供了原核生物表達人淀粉樣蛋白Aβ42表達載體的構建方法，并將表達載體導入至大腸桿菌表達宿主中，經誘導表達、兩步純化及鑒定后獲得具有高純度生物活性的目標Aβ42?His蛋白。本方法所采用的大腸表達系統，具有表達效率高、表達量大、成本低、易操作等特點，所獲得的Aβ42多肽含有His標簽方便純化，且純度高、產率高，比化學合成Aβ42具有更好的聚集特性和細胞毒性等優點。

技術領域：

本發明屬于生物技術和基因工程技術領域，特別涉及一種利用大腸桿菌表達系統表達并純化制備高純度人淀粉樣蛋白Aβ42修飾蛋白的方法，具體為重組大腸桿菌表達載體的構建及轉化方法、蛋白誘導表達及純化方法。

背景技術：

淀粉樣蛋白聚集成不溶性的淀粉纖維可導致各種神經性疾病，例如阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease，AD)，又稱老年癡呆癥，是一種神經退行性疾病。這種疾病嚴重影響著世界上數以百萬計的老年患者。據國際阿爾茨海默病協會2016年公布的數據，2015年全球約有4680萬AD患者，且其數量以20年翻一番的速度遞增，預測2050年全球將有1.3億AD患者。由于AD病程長(約10年)且患者生活需要護理，因此醫療和護理花費驚人。2015年全球AD患者的醫療花費約為8180億美元，占全球GDP的1.1％。因此該疾病的病因和尋找抗AD藥物成為世界范圍內研究人員關注的焦點。

淀粉樣蛋白斑(AD患者大腦中老年斑的主要成分)，主要是由淀粉樣β-蛋白(Aβ)聚集形成的，主要含有39-43個氨基酸。Aβ主要是通過一個含695-770個氨基酸組成的淀粉樣前體蛋白APP通過β-和γ-分泌酶水解而成，但該前體蛋白的生物功能目前尚不清楚。據報道，Aβ42是大腦中老年斑的主要成分之一。盡管目前對纖維形成過程中的聚集體的研究，已經取得了較大的進展，但很多關于這些聚集體的大小、結構、形態以及與細胞毒性之間的關系等方面目前仍存在很多未知的問題。

目前許多基于抑制Aβ42多肽聚集進行抗AD藥物的設計和篩選，為探索其聚集機制和毒理學性質，首先需要獲得高純度Aβ42。該多肽分子量大小約為4.5kDa，含有胞外和跨膜結構域。目前Aβ多肽主要通過固相化學合成法(SPPS)制備，然而SPPS合成過程中殘留的氨基酸或多肽片段均嚴重影響了Aβ的聚集和毒理特性。由于Aβ42自身存在高疏水性和易于聚集的特性，很難從神經細胞組織中提取和純化，因此難以獲得大量高純度的多肽。

基因工程方法具有能夠大量生產Aβ的優勢，目前已有一些研究組設計出一些表達系統，并表達純化獲得重組Aβ，然而由于Aβ的高疏水性和聚集體具有較高的細胞毒性，利用傳統的大腸桿菌表達系統依然存在表達量低、純化步驟復雜、獲得Aβ純度不高等缺點。利用可溶性蛋白與Aβ融合表達來增加其溶解性和穩定性可解決上述制備Aβ的缺點，然而通過該方法獲得含有Aβ融合蛋白，后續還需通過蛋白酶酶切去除融合蛋白，該方法不僅純化過程繁瑣復雜，還會造成大量蛋白的損失。

pET22b表達載體是常用的大腸表達載體之一，載體上含有T7啟動子，該啟動子為強誘導型啟動子，具有較好的選擇特異性和活性。經誘導后幾乎能啟動轉錄細胞內所有類型基因，且能夠極大提高插入基因片段的表達量。另外pET22b表達載體多克隆位點C端自帶His標簽，為后續目標蛋白的純化提供便利。

為了解決上述問題，本發明將提供一種簡易的高純度Aβ42修飾蛋白在大腸桿菌中的表達及純化方法，以獲得高產、高純度的Aβ42多肽，該多肽具有更強的聚集特性和細胞毒性，可替代目前研究中廣泛使用的化學合成的Aβ42多肽。

發明內容：

為了實現上述目的，本發明提供一種簡易的高純度Aβ42修飾蛋白及其在大腸桿菌中的表達及純化方法。