[發明專利]一種Aβ42修飾蛋白及其表達與純化方法

有效

• 申請號: 201711018671.0
• 申請日: 2017-10-27
• 公開（公告）號: CN107746432B
• 公開（公告）日: 2020-05-12
• 發明（設計）人: 劉夫鋒;賈龍剛;路福平;王文娟;李玉;張會圖
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;C07K1/22;C12N15/62;C12N15/70;G01N33/68
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

1.一種Aβ42修飾蛋白，其特征在于，所述蛋白是在Aβ42的C端的添加6個His后形成的Aβ42-His蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.編碼權利要求1所述Aβ42修飾蛋白的核酸分子，其特征在于，核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

3.權利要求1所述Aβ42-His蛋白的表達及純化方法，其特征在于，包括重組表達載體構建、轉化、誘導表達以及純化，步驟如下：

（1）將Aβ42基因插入到表達載體pET22b的多克隆位點，構建重組表達載體質粒pET22b-Aβ42；

（2）將（1）中構建的重組表達載體質粒轉入宿主細胞E. coli BL21 (DE3)，獲得重組菌株；

（3）對重組菌株進行誘導，表達Aβ42-His蛋白；

（4）誘導表達后收集菌體并破碎細胞后，使用含有尿素的變性溶液使包涵體變性；

（5）變性后過Ni-NTA樹脂，進行親和層析，采用洗脫液進行洗脫得Aβ42-His蛋白溶液；

（6）采用超純水作為透析液對步驟（5）所得的Aβ42-His蛋白溶液進行透析；

（7）透析完成后高速離心后去掉上清收集沉淀，采用六氟異丙醇溶液溶解沉淀，均勻溶解后去除溶解不完全的雜質，吸取上清進行凍干處理，即得Aβ42-His蛋白。

4.如權利要求3所述的Aβ42-His蛋白的表達及純化方法，其特征在于，具體如下：

（1）將SEQ ID No.3所示的Aβ42基因與pET22b表達載體連接轉化，挑選陽性轉化子驗證，并提取pET22b-Aβ42質粒；

（2）將測序正確的pET22b-Aβ42表達載體質粒轉化大腸桿菌表達宿主BL21(DE3)中，菌落PCR驗證轉化子，獲得大腸桿菌工程菌BL21-Aβ42；

（3）采用IPTG對工程菌BL21-Aβ42誘導蛋白表達，37°C誘導4 h，菌液離心收集菌體，獲得含有Aβ42-His蛋白的大腸桿菌菌體；

（4）用緩沖液將上述所得菌體重懸，加入終濃度30μg/mL的溶菌酶和1% PMSF，冰浴30min后超聲破碎，12000 rpm離心30 min，收集沉淀；

（5）將沉淀用含有尿素的變性溶液完全溶解后，高速離心去除沉淀，將上清經Ni-NTA樹脂親和層析柱，清洗液清洗后，用洗脫液洗脫蛋白得Aβ42-His蛋白溶液；

（6）將上述Aβ42-His蛋白溶液用超純水透析，通過高速離心，收集沉淀即為Aβ42-His纖維；

（7）將上述Aβ42-His纖維用六氟異丙醇溶解，超聲處理使得纖維充分打散，高速離心去除不溶性雜質后，吸取80%上清進行凍干處理，即得Aβ42-His蛋白單體。

5.如權利要求3所述的Aβ42-His蛋白的表達及純化方法，其特征在于，步驟（4）所述變性溶液組成為：20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 8 M 尿素, 1 mM DTT。

6.如權利要求3所述的Aβ42-His蛋白的表達及純化方法，其特征在于，步驟（5）所述洗脫液組成為：20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 5 M 尿素, 500 mM 咪唑, 1 mMDTT。

7.權利要求1所述Aβ42-His蛋白在淀粉樣蛋白聚集性研究中的應用。