[發明專利]一種提取板藍根干樣基因組DNA的方法

在審

• 申請號: 201711017592.8
• 申請日: 2017-10-26
• 公開（公告）號: CN107586773A
• 公開（公告）日: 2018-01-16
• 發明（設計）人: 鄒志文;許睿;夏斌;辛天蓉;王靜;奚劍飛
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司36115
• 代理人: 施秀瑾

技術領域

本發明屬于DNA提取技術領域，涉及板藍根基因組DNA的提取方式。

背景技術

板藍根為十字花科二年生草本植物菘藍Isatis indigotica Fort.的干燥根，是傳統的名貴中藥材之一，具有清熱、解毒、涼血消腫、利咽之功效，是我國近年來治療感冒的常用藥材。目前市售南板藍根常見混有球花馬藍、少花馬藍等偽劣品，且部分地區出現誤用或混用馬鞭草科路邊青等現象，嚴重影響了板藍根的臨床應用及其中成藥的質量。

隨著分子生物學的快速發展，利用基因組DNA檢測藥物的真偽已進入實際應用，高效地提取藥用植物基因組DNA可以有效降低該方法的應用成本。植物板藍根干樣中含多糖、蛋白質、多酚或其它不易去除的雜質，目前使用的CTAB(Cetyltrimethyl Ammonium Bromide)法大多針對提取板藍根鮮樣，而針對市售的板藍根干樣，目前的方法提取的基因組DNA得率低，成功率低且所得DNA質量較差，嚴重影響了 PCR 反應及分子鑒定等后續的工作。

發明內容

本發明的目的在于提供一種提取板藍根干樣基因組DNA的方法，以解決現有技術提取板藍根干樣基因組DNA效果不佳的問題。

本發明是通過以下技術方案實現的。

本發明所述的一種提取板藍根干樣基因組DNA的方法，其步驟如下。

（1）取去除表皮的板藍根干樣組織0.05~0.1 g，使用液氮在研缽中研磨成粉末，在組織解凍前轉移到1.5mL離心管中。

（2）加入500~750 μL的 2%的CTAB(Cetyltrimethyl Ammonium Bromide)溶液，顛倒混勻后在65℃水浴2~3 h，期間要上下顛倒混勻數次。

（3）取出離心管，加入與步驟（2）等體積的按24:1體積比混合的三氯甲烷與異戊醇的混合液，上下顛倒充分混合，晃動數次。

（4）4℃條件下14000 rpm 離心15min。

（5）用移液槍吸取管中上層水相。

（6）在抽提出的水相中加入與等體積4℃下預冷的異丙醇，輕輕晃動混勻后在-20 ℃沉淀6~12小時。

（7）4℃條件下14000 rpm 離心15min，去上清，倒置于吸水紙上控干。

（8）加入與步驟（2）等體積的無水乙醇，上下顛倒數次，洗滌沉淀，4℃條件下12000 rpm離心10min離心，去上清，倒置于吸水紙上控干。

（9）重復步驟（8）兩遍。

（10）將步驟（9）所得沉淀置于超凈工作臺中吹干。

（11）在離心管中加入30~50 μL的滅菌去離子水或者TE緩沖液(Tris-EDTA buffer solution)，4℃放置4~6小時。

（12）-20℃或-80℃低溫保存。

采用本發明的方法提取干樣板藍根組織基因組DNA，其所用試劑易得，成功率高且所得DNA質量較好，有利于PCR反應及分子鑒定等后續的工作。

具體實施方式

本發明將通過以下實施例作進一步說明。

實施例1。

（1）稱取去除表皮的板藍根干樣組織0.1g，迅速使用液氮在研缽中將其研磨成粉末，在組織解凍前轉移到1.5mL離心管中。

（2）加750 μL 的2% CTAB，顛倒混勻后在65℃水浴3 h，期間要上下顛倒混勻數次。

（3）取出離心管，加入等體積的24:1 （三氯甲烷：異戊醇）混合液，上下顛倒充分混合，晃動5 min。

（4）4℃條件下14000 rpm 離心15min，將離心管動作輕緩的取出轉子，放置于離心架上。

（5）用移液槍吸取管中上層水相。

（6）在抽提出的水相中加入等體積4℃預冷的異丙醇，輕輕晃動混勻后在-20℃沉淀6小時。

（7）在4℃條件下14000 rpm離心15 min，去上清，倒置于吸水紙上控干。

（8）加入適量700 μL 70%酒精，上下顛倒數次，4℃條件下12000 rpm離心10min，倒置于吸水紙上控干。

（9）重復步驟（8）兩遍。

（10）將步驟（9）所得沉淀置于超凈工作臺中吹干。

（11）在離心管中加入50 μL的滅菌去離子水或者TE緩沖液，4 ℃放置4小時。

（12）-80℃低溫保存。

實施例2。