[發(fā)明專利]用于快速鑒定豬的紅黑毛色基因的核酸、試劑盒及方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711017139.7
• 申請日: 2017-10-26
• 公開（公告）號: CN107586857B
• 公開（公告）日: 2021-07-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 藍(lán)靜;趙久剛;陳磊;陳四清;張廷煥;王可甜;郭宗義;謝佳嫦;曾莉
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶市畜牧科學(xué)院;重慶市生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院有限公司
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6851;C12N15/11;G16B20/20
• 代理公司: 北京智為時(shí)代知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11498
• 代理人: 王加嶺;楊靜

1.一種用于KASP基因分型快速鑒定豬的紅黑毛色基因的核酸，其特征在于，該核酸包括紅毛特異性引物、黑毛特異性引物和下游通用引物，其中，所述紅毛特異性引物的序列如SEQ ID No.1所示，所述黑毛特異性引物的序列如SEQ ID No.2所示，所述下游通用引物的序列如SEQ ID No.3所示，紅毛特異性引物的5'端標(biāo)記一個(gè)FAM熒光基團(tuán)，黑毛特異性引物的5'端標(biāo)記一個(gè)HEX熒光基團(tuán)，兩特異性引物的3'端均帶淬滅基團(tuán)。

2.含有如權(quán)利要求1所述核酸的試劑盒。

3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括用于KASP基因分型檢測所用試劑。

4.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述紅毛特異性引物對應(yīng)檢測FAM，所述黑毛特異性引物對應(yīng)檢測HEX。

5.一種用于KASP基因分型快速鑒定紅黑毛色基因方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

(1)從豬組織中提取DNA作為待測樣品；

(2)對提取的所述DNA，采用KASP基因分型試劑和如權(quán)利要求1所述用于快速鑒定豬的紅黑毛色基因的核酸進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增；同時(shí)設(shè)置含有如SEQ ID No.4所示序列作為紅毛基因陽性對照，含有如SEQ ID No.5所示序列作為黑毛基因陽性對照，含有如SEQ IDNo.4和SEQ ID No.5所示序列作為雜合子陽性對照；

(3)利用熒光定量PCR儀上的位點(diǎn)分析功能分析讀數(shù)；

(4)結(jié)果判定：根據(jù)兩種熒光基團(tuán)的熒光值在坐標(biāo)上的位置進(jìn)行判定，當(dāng)熒光值偏向代表紅毛基因的熒光基團(tuán)值的X軸，并與已知紅毛基因陽性對照聚在一起，則所述待測樣品的個(gè)體基因型為紅毛TT基因型；當(dāng)熒光值偏向代表黑毛基因的熒光基團(tuán)值的Y軸，并與已知黑毛基因陽性對照聚在一起，則所述待測樣品的個(gè)體基因型為黑毛CC基因型；當(dāng)熒光值分布偏向于坐標(biāo)45度方向，并與雜合子基因型對照個(gè)體聚在一起，則該個(gè)體基因型為TC基因型。

6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，在步驟(2)中，所述熒光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中，所述紅毛特異性引物、黑毛特異性引物及下游通用引物的引物終濃度為0.2-0.5pmol/μl，所述熒光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃15min；94℃20s，61-55℃60s，10個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)降低0.6s；94℃20s，55℃60s，26個(gè)循環(huán)。

7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，如果所述步驟(3)的結(jié)果不理想，則繼續(xù)進(jìn)行如下循環(huán)：94℃20s，57℃60s，3個(gè)循環(huán)，重新分析；

該步驟重復(fù)幾次直到不同基因型分別聚得明顯看出結(jié)果為止。

8.如權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，還包括驗(yàn)證步驟，所述驗(yàn)證步驟采用方法為：用如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示的引物對對待測樣品的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增的陽性產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果與如SEQ ID No.8所示紅毛基因型序列及如SEQID No.9所示黑毛基因型序列進(jìn)行比對，從而獲得待測樣品的基因型。

9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性94℃5分鐘；隨后進(jìn)入循環(huán)：變性94℃30秒，退火60℃30秒，延伸72℃40秒，循環(huán)35次；終延伸72℃7分鐘后結(jié)束反應(yīng)。