[發(fā)明專利]一種牡丹胚高效無菌培養(yǎng)的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711017069.5
• 申請日: 2017-10-26
• 公開（公告）號: CN107683771A
• 公開（公告）日: 2018-02-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李秀麗;戢小梅;陳法志;陳鎮(zhèn);陳志偉;戴志剛
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院林業(yè)果樹科學(xué)研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01C1/08
• 代理公司: 北京精金石專利代理事務(wù)所(普通合伙)11470
• 代理人: 強(qiáng)紅剛

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種牡丹組織培養(yǎng)的方法，尤其涉及一種牡丹胚高效無菌培養(yǎng)的方法。

背景技術(shù)

牡丹(Paeonia suffruticosa)屬于芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(Paeonia)牡丹組(Paeonia sect.Moutan DC.)的灌木植物，是中國十大名花之一，被譽(yù)為“花中之王”。牡丹的9個野生種均原產(chǎn)于中國，并且已有數(shù)千年的自然生長和1500多年的人工栽培歷史，目前已經(jīng)引種至日本、歐洲和美國等地區(qū)。牡丹也因極具藥用和油用價值而備受關(guān)注，2014年國務(wù)院辦公廳頒發(fā)了《關(guān)于加快木本油料產(chǎn)業(yè)發(fā)展的意見》(國辦發(fā)[2014]68號)，油用牡丹作為重點(diǎn)推介的木本油料植物被大力推廣種植。2014年，牡丹在全國的種植面積達(dá)6.67萬hm²，2015年發(fā)展到13.33萬hm²。然而，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上普遍采用播種育苗、分株和嫁接的方法對牡丹進(jìn)行育苗和良種擴(kuò)繁，但是牡丹種子生根困難，生根率低，優(yōu)良株系缺乏，并且可用于嫁接的材料短缺，這些因素導(dǎo)致牡丹良種的繁殖系數(shù)低，生產(chǎn)周期長，嚴(yán)重制約著品種的繁育及推廣，抑制了牡丹產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)和規(guī)模化生產(chǎn)。

植物組織培養(yǎng)是一種重要的無性繁殖手段，具有快速、高效的優(yōu)點(diǎn)，能有效提高牡丹的繁殖系數(shù)，保持親代的優(yōu)良性狀，是促進(jìn)牡丹產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的重要技術(shù)。早在1965年P(guān)artanen就開始了牡丹的組織培養(yǎng)研究，中國也有20多年的牡丹組織培養(yǎng)研究歷史，雖然牡丹組織培養(yǎng)體系日漸完善，但還有諸多問題需要解決。如：牡丹的芽誘導(dǎo)率低、褐化玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重、生根率低、移栽率低等，因此，優(yōu)化組培體系，形成高質(zhì)量的組培苗是亟待解決的問題，其中以胚為外植體進(jìn)行的胚高效無菌培養(yǎng)技術(shù)是牡丹組織培養(yǎng)的重要研究內(nèi)容。現(xiàn)有研究顯示：牡丹種皮堅硬光滑，無菌操作過程中用解剖刀(解剖剪)從種子內(nèi)取胚非常耗時耗力，大大降低了工作效率；直接對離體的胚滅菌時，往往會出現(xiàn)高誘導(dǎo)率伴隨高污染率或低污染率伴隨低誘導(dǎo)率的現(xiàn)象，很難做到低污染率和高誘導(dǎo)率并存。因此研究牡丹胚高效無菌培養(yǎng)的新技術(shù)，對于油用牡丹組織培養(yǎng)的深入研究和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)具有現(xiàn)實(shí)意義。

通過檢索國內(nèi)外現(xiàn)有技術(shù)，目前尚未發(fā)現(xiàn)綜合不同的滅菌方式、培養(yǎng)基及激素添加量和胚的不同發(fā)育時期等方面深入研究有效提高牡丹胚無菌培養(yǎng)的新方法。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種牡丹胚高效無菌培養(yǎng)的方法，以克服芽誘導(dǎo)率低和污染率高的問題，從而填補(bǔ)牡丹胚高效無菌培養(yǎng)技術(shù)的空白。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明人通過大量試驗(yàn)研究并不懈探索，最終獲得了如下技術(shù)方案：一種牡丹胚高效無菌培養(yǎng)的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：

(1)選取花后50～500d的牡丹種子；

(2)牡丹種子用流水沖洗干凈后，加入殺菌劑溶液中浸泡5～150min，蒸餾水沖洗，再加入400～600mg·L^-1的GA(gibberellin，赤霉素)浸泡30～50h，收集下沉的種子并用蒸餾水沖洗干凈后置于超凈工作臺上的無菌三角瓶中；

(3)將種子用75％的(v/v)乙醇消毒1～3min，2％次氯酸鈉溶液消毒10～15min，無菌水清洗2-10次，注意：期間需要不停的搖動三角瓶，使溶液與種子充分接觸，提高滅菌效果；

(4)手拿種子，種臍至于上方，用滅菌的修枝剪沿中間部位從下至上剪開種子，無菌鑷子取出靠近種臍的胚，直接接入備好的培養(yǎng)基中，所述的培養(yǎng)基為1/2MS或MS+0.01～0.03mg·L^-1NAA(1-naphthaleneacetic acid，α-萘乙酸)+1～2mg·L^-1 6-BA(6-benzyladenine，6-芐基腺嘌呤)；每瓶接種3～5個胚，接種后進(jìn)行靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度25±1℃，光照10～12h/d。

進(jìn)一步優(yōu)選地，如上所述牡丹胚高效無菌培養(yǎng)的方法，其中步驟(1)中的花后時間為90～110d的當(dāng)年生種子。

進(jìn)一步優(yōu)選地，如上所述牡丹胚高效無菌培養(yǎng)的方法，其中步驟(2)中所述的殺菌劑溶液為800倍的多菌靈。

進(jìn)一步優(yōu)選地，如上所述牡丹胚高效無菌培養(yǎng)的方法，其中步驟(2)中GA濃度為500mg·L^-1，浸泡時間為46～48h。

進(jìn)一步優(yōu)選地，如上所述牡丹胚高效無菌培養(yǎng)的方法，其中步驟(3)中乙醇消毒時間為1min，次氯酸鈉溶液消毒時間為10min。