[發(fā)明專利]重組分泌型大腸桿菌高密度發(fā)酵方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711009923.3
• 申請(qǐng)日: 2017-10-25
• 公開（公告）號(hào): CN107513517A
• 公開（公告）日: 2017-12-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 雷振松;王勇波
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 德清知諾同豐生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N1/04;C12R1/19
• 代理公司: 杭州千克知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司33246
• 代理人: 裴金華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種重組分泌型大腸桿菌高密度發(fā)酵方法。

背景技術(shù)

蛋白分泌表達(dá)是指重組異源蛋白通過運(yùn)輸或分泌方式定位于細(xì)胞周質(zhì)，甚至穿過外膜進(jìn)入培養(yǎng)基中。重組蛋白分泌表達(dá)的優(yōu)勢(shì)在于胞周質(zhì)或胞外分泌表達(dá)過程中，信號(hào)肽在細(xì)胞內(nèi)剪切，更有可能產(chǎn)生目的蛋白的天然N-末端，如果含甲硫氨酸可能會(huì)降低產(chǎn)物的可溶性和穩(wěn)定性，大腸桿菌的胞周質(zhì)中含有一系列的酶，并提供了一個(gè)氧化環(huán)境，有利于二硫鍵的正確形成，并增強(qiáng)巰基蛋白的正確折疊，使活性蛋白質(zhì)的產(chǎn)量得到提高，蛋白分泌性表達(dá)，減少了對(duì)宿主菌的毒性和代謝負(fù)擔(dān)，使宿主菌適應(yīng)性增加，且周質(zhì)空間和胞外培養(yǎng)基中宿主菌蛋白含量很低，有利于目的蛋白的純化。

大腸桿菌具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、遺傳背景清晰、生產(chǎn)周期短、生長(zhǎng)條件清楚等優(yōu)點(diǎn)。隨著基因工程技術(shù)和大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，重組大腸桿菌越來越多地應(yīng)用到重組蛋白藥物、氨基酸、酶制劑等產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)中。重組分泌型大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)與傳統(tǒng)胞內(nèi)表達(dá)系統(tǒng)相比有很大優(yōu)勢(shì)。但由于重組分泌型大腸桿菌穩(wěn)定性較差，長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)容易發(fā)生菌種退化，活力降低，導(dǎo)致生產(chǎn)中產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量降低。傳統(tǒng)的發(fā)酵方法和補(bǔ)料方法，無法使菌體生長(zhǎng)到高密度，限制了產(chǎn)品產(chǎn)量的提升。因此，研發(fā)重組分泌型大腸桿菌高密度發(fā)酵方法具有重大的意義。

在中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)公開說明書CN104293668A中公開了一種重組大腸桿菌高密度發(fā)酵的方法，采用三級(jí)菌種保藏方法保藏構(gòu)建后的重組大腸桿菌，并經(jīng)過活化、搖瓶培養(yǎng)、種子罐培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐進(jìn)行通氣攪拌發(fā)酵罐培養(yǎng)，在發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中通過提高攪拌轉(zhuǎn)速及空氣流量來保證溶解氧水平，并根據(jù)pH的變化調(diào)整補(bǔ)料速度，當(dāng)菌體生長(zhǎng)至一定階段后加入誘導(dǎo)劑，并降溫發(fā)酵至結(jié)束。這種方法采用了三級(jí)菌種保藏方法，一定程度上提升了有效保藏期，降低了發(fā)酵過程中由于菌種退化出現(xiàn)生產(chǎn)異常現(xiàn)象的概率，但所用菌種表達(dá)目的蛋白的概率仍然取決于構(gòu)建后的重組大腸桿菌，且保藏方法復(fù)雜，涉及到無菌條件下的分裝和真空冷凍干燥等工藝，對(duì)操作人員和設(shè)備的要求高，成本高，而且提升了因外來菌種的進(jìn)入而導(dǎo)致菌種異常的風(fēng)險(xiǎn)。此外，優(yōu)化了發(fā)酵、補(bǔ)料培養(yǎng)基及補(bǔ)料方法，一定程度上改善了菌體快速生長(zhǎng)代謝所需營(yíng)養(yǎng)條件及外部環(huán)境，提高了放罐時(shí)菌體含量及產(chǎn)物產(chǎn)量，但仍需進(jìn)一步優(yōu)化高密度發(fā)酵工藝，提升細(xì)菌生長(zhǎng)密度，縮短發(fā)酵周期，提升產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提出一種表達(dá)目的蛋白的概率高、大幅降低外來菌種進(jìn)入而導(dǎo)致菌種異常的風(fēng)險(xiǎn)、生長(zhǎng)密度大、發(fā)酵周期短、操作簡(jiǎn)單且低成本的重組分泌型大腸桿菌高密度發(fā)酵方法。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是，提出一種重組分泌型大腸桿菌高密度發(fā)酵方法，包括下列步驟：

將構(gòu)建好的重組分泌型大腸桿菌進(jìn)行原始菌種保存；篩選高表達(dá)菌種；將所述篩選得到的高表達(dá)菌種進(jìn)行工作菌種保存；將所述工作菌種進(jìn)行活化；轉(zhuǎn)接搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)；接種發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵；所述接種發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵包括下列步驟：通過調(diào)節(jié)罐壓、通氣量、攪拌速度、補(bǔ)料速度控制溶氧條件；根據(jù)溶氧、pH值等變化調(diào)節(jié)補(bǔ)料培養(yǎng)基的流加速度；待菌體達(dá)到高密度后，通過控制補(bǔ)料培養(yǎng)基的流加速度，調(diào)節(jié)菌體生長(zhǎng)速度，降溫發(fā)酵至結(jié)束。

作為優(yōu)選，所述接種發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵包括下列步驟：將上罐種子液按1:50比例接種于經(jīng)過高溫滅菌過的發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中進(jìn)行通氣，攪拌培養(yǎng)，初始培養(yǎng)條件包括：轉(zhuǎn)速200-400轉(zhuǎn)/分，通氣量20-40升/分，罐壓0.005-0.015MPa，pH6.8-7.2，溫度35-39℃；當(dāng)細(xì)菌密度增加，溶氧逐漸降低，提高轉(zhuǎn)速，通氣量，罐壓等條件，調(diào)節(jié)補(bǔ)料培養(yǎng)基流加速度，保持溶氧不低于20%；所述發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括：磷酸氫二鉀0.2-0.4%，磷酸二氫鈉0.05-0.15%，氯化鉀0.1-0.2%，葡萄糖0.06-0.1%，檸檬酸三鈉0.05-0.15%，硫酸銨0.4-0.6%，酵母粉0.1-0.3%，蛋白胨0.3-0.5%，硫酸鎂0.2-0.4%，微量元素0.05-0.15%；所述補(bǔ)料培養(yǎng)基包括：葡萄糖30-70%，酵母粉0.5-1.5%，蛋白胨1-5%。

作為優(yōu)選，所述初始培養(yǎng)條件包括：轉(zhuǎn)速300轉(zhuǎn)/分，通氣量30升/分，罐壓0.01MPa，pH7.0，溫度37℃。