[發(fā)明專利]重組分泌型大腸桿菌高密度發(fā)酵方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711009923.3
• 申請(qǐng)日: 2017-10-25
• 公開（公告）號(hào): CN107513517A
• 公開（公告）日: 2017-12-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 雷振松;王勇波
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 德清知諾同豐生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N1/04;C12R1/19
• 代理公司: 杭州千克知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司33246
• 代理人: 裴金華

1.一種重組分泌型大腸桿菌高密度發(fā)酵方法，其特征在于包括下列步驟：

將構(gòu)建好的重組分泌型大腸桿菌進(jìn)行原始菌種保存；

篩選高表達(dá)菌種；

將所述篩選得到的高表達(dá)菌種進(jìn)行工作菌種保存；

將所述工作菌種進(jìn)行活化；

轉(zhuǎn)接搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)；

接種發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵；所述接種發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵包括下列步驟：通過調(diào)節(jié)罐壓、通氣量、攪拌速度、補(bǔ)料速度控制溶氧條件；根據(jù)溶氧、pH值等變化調(diào)節(jié)補(bǔ)料培養(yǎng)基的流加速度；待菌體達(dá)到高密度后，通過控制補(bǔ)料培養(yǎng)基的流加速度，調(diào)節(jié)菌體生長速度，降溫發(fā)酵至結(jié)束。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組分泌型大腸桿菌高密度發(fā)酵方法，其特征在于所述接種發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵包括下列步驟：

將上罐種子液按1:50比例接種于經(jīng)過高溫滅菌過的發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中進(jìn)行通氣，攪拌培養(yǎng)，初始培養(yǎng)條件包括：轉(zhuǎn)速200-400轉(zhuǎn)/分，通氣量20-40升/分，罐壓0.005-0.015MPa，pH6.8-7.2，溫度35-39℃；當(dāng)細(xì)菌密度增加，溶氧逐漸降低，提高轉(zhuǎn)速，通氣量，罐壓等條件，調(diào)節(jié)補(bǔ)料培養(yǎng)基流加速度，保持溶氧不低于20%；所述發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括：磷酸氫二鉀0.2-0.4%，磷酸二氫鈉0.05-0.15%，氯化鉀0.1-0.2%，葡萄糖0.06-0.1%，檸檬酸三鈉0.05-0.15%，硫酸銨0.4-0.6%，酵母粉0.1-0.3%，蛋白胨0.3-0.5%，硫酸鎂0.2-0.4%，微量元素0.05-0.15%；所述補(bǔ)料培養(yǎng)基包括：葡萄糖30-70%，酵母粉0.5-1.5%，蛋白胨1-5%。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組分泌型大腸桿菌高密度發(fā)酵方法，其特征在于所述初始培養(yǎng)條件包括：

轉(zhuǎn)速300轉(zhuǎn)/分，通氣量30升/分，罐壓0.01MPa，pH7.0，溫度37℃。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組分泌型大腸桿菌高密度發(fā)酵方法，其特征在于：

所述發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括：磷酸氫二鉀0.3%，磷酸二氫鈉0.1%，氯化鉀0.15%，葡萄糖0.08%，檸檬酸三鈉0.1%，硫酸銨0.5%，酵母粉0.2%，蛋白胨0.4%，硫酸鎂0.3%，微量元素0.1%；

所述補(bǔ)料培養(yǎng)基包括：葡萄糖50%，酵母粉1%，蛋白胨3%。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的重組分泌型大腸桿菌高密度發(fā)酵方法，其特征在于，所述原始菌種保存包括下列步驟：

將構(gòu)建好的重組分泌型大腸桿菌以1%的比例接種于含抗生素的50ml LB液體培養(yǎng)基，在37℃、轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分的恒溫空氣搖床培養(yǎng)4-12小時(shí)，檢測OD₆₀₀值在2.0-3.0之間，取樣染色鏡檢確認(rèn)無雜菌污染后，取菌液和30%甘油按1:1比例混勻后封口膜密封，保存于-80℃冰箱。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的重組分泌型大腸桿菌高密度發(fā)酵方法，其特征在于所述篩選高表達(dá)菌種包括下列步驟：

將構(gòu)建好的重組分泌型大腸桿菌按1:10接種于含抗生素的液體篩選培養(yǎng)基；所述液體篩選培養(yǎng)基包括：酵母粉0.04-0.08%、蛋白胨0.10-0.14%、氯化鈉0.10-0.14%、硫酸鎂0.02-0.06%、氯化鉀0.3-0.4%、2-8mM Tris；所述液體篩選培養(yǎng)基用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.0-7.2；

在35-39℃的恒溫空氣搖床培養(yǎng)8-24小時(shí)后，測量菌液OD₆₀₀并做鏡檢，搖瓶取樣做全菌和裂解液電泳，根據(jù)電泳結(jié)果評(píng)定表達(dá)結(jié)果最好的菌株作為工作菌種。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組分泌型大腸桿菌高密度發(fā)酵方法，其特征在于：

所述液體篩選培養(yǎng)基的體積為50ml；所述液體篩選培養(yǎng)基包括：酵母粉0.06%、蛋白胨0.12%、氯化鈉0.12%、硫酸鎂0.04%、氯化鉀0.34%、5mM Tris；

所述恒溫空氣搖床培養(yǎng)時(shí)的轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分。