[發(fā)明專利]前列腺癌特異性外泌體、lncRNA及其制備方法和應用

有效

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• 申請日: 2017-10-25
• 公開（公告）號: CN107828779B
• 公開（公告）日: 2020-04-21
• 發(fā)明（設計）人: 汪付兵;王宇慧;陳浩
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/11;C12Q1/6886;G01N33/574;G01N33/543
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 余曉雪;王敏鋒

本發(fā)明公開了一種前列腺癌特異性外泌體的制備方法。本發(fā)明還公開了一種前列腺癌特異性外泌體及其應用。本發(fā)明還公開了一種前列腺癌外泌體中的長鏈非編碼RNA SAP30L?AS1和SChLAP1的制備方法。本發(fā)明還公開了前列腺癌外泌體中的長鏈非編碼RNA SAP30L?AS1和SChLAP1表達量的試劑在制備用于前列腺癌診斷試劑中的應用。本發(fā)明還公開了一種前列腺癌診斷試劑盒。本發(fā)明可以成功分離前列腺癌患者血漿中前列腺癌特異性外泌體，并進行長鏈非編碼RNA SAP30L?AS1和SChLAP1的檢測。本發(fā)明的診斷效能及靈敏度和特異度均顯著提高。

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術和腫瘤分子生物技術領域，具體涉及前列腺癌特異性外泌體、lncRNA及其制備方法和應用，尤其涉及用雙抗體偶聯(lián)免疫磁珠的方法分離前列腺癌患者血漿中腫瘤來源外泌體及其lncRNA SAP30L-AS1和lncRNA SChLAP1作為前列腺癌診斷標志物及用于前列腺癌早期診斷的試劑盒。

背景技術

根據(jù)最新的癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析，前列腺癌(PCa)是世界上男性癌癥死亡的主要原因之一，2016年，美國新增前列腺癌病例約占新診斷癌癥患者人數(shù)的21％，我國前列腺癌的發(fā)病率也迅速上升。在早期階段前列腺癌的主要治療方法是去勢治療，但是在晚期階段進展為去勢抗性前列腺癌(CRPC)，中位生存期僅約為2至3個月。目前，前列腺特異性抗原(PSA)的血漿定量檢測使眾多前列腺癌患者得以診斷，但由于PSA具有前列腺組織特異性，因此在某些良性病變如良性前列腺增生(BPH)和前列腺炎中升高，導致其特異性下降，假陽性會引起患者不必要的有創(chuàng)活檢和過度治療。因此尋找早期診斷前列腺癌的分子標志物是前列腺癌研究的重點。

外泌體是一種由多種細胞分泌并可以在多種組織細胞間傳遞的30～100nm的囊泡，存在于血液、尿液、唾液和乳汁等多種體液中，其含有脂質、供體細胞來源的特異性蛋白質、以及l(fā)ongnon-coding RNA、microRNA等非編碼RNA和DNA等。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是長度大于200個核苷酸、不具備蛋白編碼能力的轉錄本。隨著癌癥轉錄組研究的進展，發(fā)現(xiàn)lncRNA在人類基因轉錄、轉錄后調節(jié)、細胞生長、增殖、分化及表觀遺傳方面起著重要作用，且具有復雜的生物學功能，與疾病的發(fā)生、發(fā)展、診斷及治療密切相關。而外泌體可以為細胞外核酸提供保護，還能作為有效的載體將其轉運到靶細胞中，腫瘤來源的外泌體由于RNA含量較高，且在腫瘤自身的遺傳信息傳遞中發(fā)揮重要作用，調控細胞功能與腫瘤微環(huán)境，影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉移。以往研究表明，在乳腺癌中，lncRNA-21A可能通過調節(jié)著絲粒蛋白F(CENP-F)的表達而影響細胞的增殖,當乳腺癌細胞吞噬富lncRNA-21A的外泌體后，癌細胞的侵襲能力會有所下降；在肝癌中，外泌體來源的lncRNA ROR可促進肝癌細胞在缺血環(huán)境下的存活且在對化療的抵抗性中也發(fā)揮重要作用；在胃癌中，血漿中l(wèi)nc00152主要存于外泌體中，相較傳統(tǒng)的生物學標志物癌胚抗原和CAl99，血漿外泌體的lnc00152更具診斷優(yōu)勢。因此，這些腫瘤細胞來源外泌體中特異性lncRNA標志物就會成為腫瘤診斷檢測的高特異性指標，能克服直接從血液中提取RNA進行檢測過程中非檢測物質的干擾，并且可以暗示出腫瘤發(fā)展情況和侵襲程度，通過檢測體液尤其是外周血中的外泌體的情況使基于外泌體的診斷和隨訪更加容易。

外泌體常用的分離方法有超速離心法、磁珠免疫捕獲法、沉淀法。超速離心法耗時耗力，需要大量初始樣本；磁珠免疫捕獲法特異性高，操作方便，但目前基于外泌體的標志物(CD63、CD9蛋白)的方法不能反映腫瘤的特異性；沉淀法時間短，可行性強，但外泌體特異性差，純度低。