[發明專利]一種細胞內膽固醇敏感度和定位的測量方法及其診斷試劑

在審

• 申請號: 201711009090.0
• 申請日: 2017-10-25
• 公開（公告）號: CN107807245A
• 公開（公告）日: 2018-03-16
• 發明（設計）人: 阮雄中
• 申請（專利權）人: 阮雄中
• 主分類號: G01N33/92
• 分類號: G01N33/92;G01N33/50;C12Q1/6883
• 代理公司: 北京旭路知識產權代理有限公司11567
• 代理人: 王瑩

1.一種膽固醇敏感度的測量方法，其特征在于：包括LDL標準品的制備、細胞培養方法、RNA提取方法以及一步法熒光定量RT-PCR四大步驟；

其中，LDL標準品的制備具體步驟如下：

(一)、取健康自愿者血漿，加入抗氧化劑；

(二)、10000g以下離心30min，去除乳糜微粒；

(三)、然后加溴化鈉將血漿以密度調整為1.006kg/L，40000r/min超速離心18h，吸出上層乳白色液體及次層淡黃色液體，收集下層液體；

(四)、再加入溴化鈉(NaBr)調整其終密度為1.063gkg/L，再次40000r/min超速離心24h，吸出上層橙黃色液體即獲LDL；

其中，細胞培養方法具體步驟如下：

(一)、將分離健康人和疾病人群的PBMC，小部分細胞直接用于檢測PBMC內膽固醇敏感器SCAP的表達水平；

(二)、大部分細胞用含10％的無脂血清的RPMI1640培養基，種在12孔板中，培養12小時；

(三)、然后與用上述方法制備的不同濃度的LDL膽固醇，濃度分別為0、25、50、100、200μl/ml，共孵育24小時，然后按照下列方法提取mRNA；

其中，RNA提取方法為采用Trizol來提取PBMC的RNA，然后分離RNA；

其中，一步法熒光定量RT-PCR，采用一步法完成反轉錄和PCR兩個過程，不必再取出cDNA；

試劑包括經過優化的緩沖液、RT-PCR MIX，dNTP、Sybr green I染料和MgCl2溶液混合物，并擬使用定量熒光PCR檢測PBMC的SCAP的表達水平，以及不同濃度LDL刺激下LDLr和HMGCoAR的mRNA水平,并計算50％LDLr和HMGCoAR被抑制時LDL膽固醇的濃度，反映細胞/機體對膽固醇的敏感度，根據不同濃度LDL狀態下，LDLr和HMGCoAR mRNA的水平，計算出IC50。

2.如權利要求1所述的膽固醇敏感度的測量方法，其特征在于：所述抗氧化劑為100umol/L EDTA、20umol/L丁羥甲苯。

3.一種膽固醇敏感度的測量的檢測試劑盒，其特征在于：其中包括權利要求1的幾部分的試劑，定量熒光RT-PCR試劑可適合任意熒光定量PCR儀。

4.一種驗證膽固醇敏感度IC50的準確性的方法，其特征在于：

(一)、U937細胞用含10％的無脂血清的RPMI1640培養基，種在12孔板中，培養12小時，與用上述方法制備的不同濃度的LDL膽固醇共孵育24小時，然后用Trizol提取細胞總RNA，一步法熒光定量RT-PCR，根據不同濃度LDL狀態下，LDLr和HMGCoAR mRNA的水平，并用Excel軟件作出量效關系曲線，擬和線性回歸方程計算mRNA IC50；

(二)、用基因轉染的方法，在CHO細胞上建立不同表達水平SCAP超表達的細胞系，轉染了不同濃度的SCAP的CHO細胞，用含10％的無脂血清的RPMI1640培養基，種在12孔板中，培養12小時，然后用Trizol提取細胞總RNA，使用定量熒光PCR檢測SCAP的表達水平，與PBMC內膽固醇敏感器SCAP的表達水平比較，用此細胞作為陽性對照來檢查試劑盒對PBMC內SCAP定量檢測的上述方法的準確性和靈敏性，并根據檢測結果對各種實驗條件及生產工藝進行調整，使試劑盒的準確性和靈敏度達到技術要求的標準。

5.一種細胞內膽固醇的定位檢測方法，其特征在于：新鮮分離的PBMC細胞并涂片并固定、游離膽固醇和內質網特異的熒光雙探針孵育，標記、細胞內螢光定量和校正四大步驟；

其中，新鮮分離的PBMC細胞并涂片，具體步驟如下：

(一)、將分離健康人和疾病人群的PBMC，并用離心涂片機涂片；

(二)、細胞用3％多聚甲醛固定；

其中，游離膽固醇和內質網特異的熒光雙探針孵育，標記，具體步驟如下：

用膽固醇染料或者膽固醇敏感器(蛋白或特異肽)和內質網特異的熒光雙探針孵育，標記；

其中，細胞內螢光定量和校正四大步驟，具體步驟如下：

用熒光顯微鏡觀測細胞器內游離膽固醇的含量并用Sigma Scan Pro software對熒光進行定量，并用細胞總面積來校正結果。

6.一種細胞內膽固醇的定位檢測試劑盒，其特征在于：其中包括權利要求1的幾部分的試劑。

7.一種細胞內膽固醇的定位檢測的準確性的方法，其特征在于：

(一)為了評估此方法的正確性，還將選用密度梯度超高速離心法分離內質網并直接測量內質網和線粒體膽固醇的方法來佐證雙熒光探針法的準確性；

(二)臨床評估：人群選擇參照第一部分，我們將用雙熒光探針標記法細胞內膽固醇定位快速診斷試劑測量正常人群和疾病人群PBMC內膽固醇的含量，建立正常健康人群PBMC內膽固醇含量的基線；并探討其與血膽固醇水平、動脈硬化之間的相關性。