[發(fā)明專利]大鼠血漿中高半胱氨酸和半胱氨酸的檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711006838.1
• 申請日: 2017-10-24
• 公開（公告）號: CN107907618A
• 公開（公告）日: 2018-04-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔣心惠;黃丹;杜婷婷
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/62;G01N30/86
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)藥化學(xué)檢測領(lǐng)域，更具體地說，本發(fā)明涉及一種大鼠血漿高半胱氨酸和半胱氨酸的檢測方法。

背景技術(shù)

高半胱氨酸是一種含巰基的氨基酸，在體內(nèi)主要有以下幾種形式存在，高半胱氨酸游離態(tài)，高半胱氨酸雙分子聚集成二硫化物，高半胱氨酸與蛋白質(zhì)結(jié)合，且正常人體血漿中，70％高半胱氨酸與蛋白質(zhì)結(jié)合。高半胱氨酸主要來自于食物中攝取的蛋氨酸，是蛋氨酸和半胱氨酸代謝過程中的中間產(chǎn)物，其本身不參加蛋白質(zhì)的合成。蛋氨酸和高半胱氨酸可相互轉(zhuǎn)化。高半胱氨酸可以與膽堿的中間代謝產(chǎn)物甜菜堿作用，即甜菜堿作為甲基供體，高半胱氨酸和甜菜堿在甜菜堿高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下形成蛋氨酸。高半胱氨酸和半胱氨酸的含量存在密切的關(guān)系，半胱氨酸可參與蛋白質(zhì)的合成，還可與谷氨酸、甘氨酸形成谷胱甘肽。高半胱氨酸通過轉(zhuǎn)巰基途徑，即高半胱氨酸在絲氨酸和胱硫醚β合成酶條件下形成胱硫醚，胱硫醚在胱硫醚裂解酶作用下形成半胱氨酸。目前，高半胱氨酸的堆積被認(rèn)為是造成動脈粥樣硬化癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。體內(nèi)膽堿，甜菜堿，葉酸的缺乏均可造成高半胱氨酸的堆積，而且甜菜堿的缺乏可導(dǎo)致糖尿病，嚴(yán)重者則可能會出現(xiàn)糖尿病腦病。而且高半胱氨酸在體內(nèi)的堆積可能會造成心血管系統(tǒng)損害及中風(fēng)。高半胱氨酸血癥可能會引起人體產(chǎn)生認(rèn)知障礙，更嚴(yán)重的可引起腦病。因此，對體內(nèi)高半胱氨酸和半胱氨酸的定量測定顯得越發(fā)重要。

目前，對高半胱氨酸和半胱氨酸的測定常用的方法有同位素法，但該方法繁瑣且具有放射污染，不適合廣泛應(yīng)用。GC-MS可同時(shí)測定高半胱氨酸等多種物質(zhì)，盡管該方法有靈敏度好，特異性好等優(yōu)點(diǎn)，但儀器設(shè)備價(jià)格昂貴而不能推廣。HPLC-FLD也用于測定高半胱氨酸，由于該方法需要用鄰苯二甲醛衍生，而且在衍生前需要封閉巰基對衍生的影響，該方法操作過于繁瑣。HPLC-ECD檢測法操作簡單，準(zhǔn)確度高，可同時(shí)測定多種含巰基物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種同時(shí)檢測大鼠血漿中高半胱氨酸和半胱氨酸的方法。

為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的，提供了一種大鼠血漿中高半胱氨酸和半胱氨酸的檢測方法，包括以下步驟：

步驟一、標(biāo)準(zhǔn)品的配制；

步驟二、用硼氫化鈉將樣品進(jìn)行還原；

步驟三、除血漿樣品中的蛋白質(zhì)；

步驟四、HPLC-ECD分離測定血漿樣品中高半胱氨酸和半胱氨酸。

步驟五、結(jié)果計(jì)算。

優(yōu)選的是，步驟一中對標(biāo)準(zhǔn)品的配制具體方法為：

以高半胱氨酸，半胱氨酸和香草酸為標(biāo)準(zhǔn)品，分別用0.1mol/L高氯酸溶液配制成濃度為1mg/mL的儲備液，備用；

優(yōu)選的是，步驟二中對樣品的還原的具體方法為：

步驟a、配制1.5mol/L NaoH溶液，稱取適量硼氫化鈉溶于1.5mol/L NaoH溶液中，使硼氫化鈉的濃度為2mol/L；

步驟b、取100μL血漿樣品，向樣品中加入10μL 2mol/L的硼氫化鈉溶液，渦旋1min，靜置反應(yīng)5min。

優(yōu)選的是，步驟三中除血漿樣品中蛋白質(zhì)的具體方法為：

按樣品和高氯酸按體積比為1∶3向步驟一中的樣品加入300μL 0.4mol/L高氯酸(含內(nèi)標(biāo)，香草酸)，渦旋混勻1min，15000×g，4℃離心15min，取上清液供HPLC-ECD測定。

優(yōu)選的是，步驟四中HPLC-ECD分離測定血漿樣品中高半胱氨酸和半胱氨酸，測定條件如下：

檢測器：島津ED723電化學(xué)檢測器；

色譜柱：依利特C8(E2020417，4.6mm×250mm，5μm)；

流動相A：甲醇；

流動相B：30mmol/L醋酸鈉，100μmol/L辛烷磺酸鈉，pH＝5.02，

等度洗脫，洗脫程序?yàn)椋篈∶B＝0.1∶99.9；

柱溫：30℃；

流速：0.7mL/min；

檢測電壓：900mv；

進(jìn)樣量：20μL。

優(yōu)選的是，步驟五中結(jié)果計(jì)算具體為：

按公式(1)計(jì)算樣品中高半胱氨酸的含量；按公式(2)計(jì)算樣品中半胱氨酸的含量；

Y＝0.8499X+0.0288(1)

Y＝0.5278X-0.0014(2)

式中：

Y：待測物與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積之比；

X：待測物的濃度，單位為微克每毫升。

本發(fā)明至少包括以下有益效果：

1、本發(fā)明提供的ED723電化學(xué)檢測器，穩(wěn)定性好，靈敏度好。