[發明專利]一種用于檢測登革病毒的熒光RT?RAA引物、探針及檢測方法

在審

• 申請號: 201711005655.8
• 申請日: 2017-10-25
• 公開（公告）號: CN107619885A
• 公開（公告）日: 2018-01-23
• 發明（設計）人: 周冬根;羅潔;應清界;俞雪鈞
• 申請（專利權）人: 寧波國際旅行衛生保健中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京華仲龍騰專利代理事務所(普通合伙)11548
• 代理人: 董濤

技術領域

本發明屬于體外核酸檢測領域，具體涉及一種用于檢測血液樣品中登革病毒(Dengue virus，DENV)的熒光RT-RAA引物、探針和檢測方法。

背景技術

登革熱(Dengue Fever)是由登革病毒(Dengue virus，DENV)引起,經伊蚊傳播的一種急性傳染病，是熱帶及亞熱帶地區兒童死亡的主要原因之一，其潛伏期通常約5-7天，具有傳播迅猛、發病率高等特點?；颊哂锌赡艹霈F極度疲倦及抑郁癥狀，少數病者會惡化至登革出血熱，并進一步出血、休克，乃至死亡，登革熱引起的并發癥往往是病人致死的主因。登革熱發病率最近幾十年在全球大幅度上升。最近一項研究估計，每年約有3.9億例登革熱感染(95％置信區間2.84-5.28億)，其中9600萬(0.67-1.36億)出現(不同嚴重程度的)臨床癥狀。另一項有關登革熱流行程度的研究表明，全世界有128個國家的39億人面臨登革熱病毒感染風險。因此，為及時有效發現登革病毒，將該病毒防范于國門之外，建立快速、敏感、特異的DENV檢測方法十分必要。

隨著全球化發展，方便、快捷的交通運輸工具使旅游及不同國家和地區動物、動物產品的跨境移動日益頻繁，也給傳染病的傳播和流行創造了有利條件。此外，登革早期感染呈現不典型癥狀，與基孔肯雅病毒、寨卡病毒、乙腦病毒等其它蟲媒病毒感染癥狀類似，很難區分，無疑進一步加大了登革病毒的防控難度。因此，建立快速診斷DENV感染的實驗室方法顯得尤為重要。

傳統的檢測方法檢測周期長，且分離陽性率低，往往會延誤病程和疫情的控制。分子生物學診斷方法可以在病毒血癥時期檢測到病毒的感染，并且快速靈敏，目前已被廣泛的應用于DENV病毒的檢測。目前，國內外已建立的DENV檢測方法有實時RT-PCR檢測方法、半巢式PCR檢測方法、LAMP檢測方法等，但PCR方法需要使用復雜的儀器和裝備精良的實驗室，而LAMP方法引物較復雜，必須用特殊的軟件設計，且用LAMP方法得到的擴增產物是一些大小不等的片段，無法直接克隆和測序，只能用于判斷目的基因的存在。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種用于檢測登革病毒的引物對，所述引物對包括下述1)-3)中的至少一種：

1)序列表中SEQ ID№：1所示核苷酸序列和序列表中SEQ ID№：2所示核苷酸序列；

2)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID№：1限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；和在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID№：2限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；

3)與1)、或2)限定的核苷酸序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的核苷酸序列。

具體的，所述同源性為95％以上；再具體的為96％以上；再具體的為97％以上；再具體的為98％以上；再具體的為99％以上。

上述高嚴謹條件可為用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下雜交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

所述具有相同功能具體包括能用于檢測登革病毒的核苷酸序列。

本發明的再一個目的是提供一種用于檢測登革病毒的探針，所述探針包括下述1)-3)中的至少一種：

1)所述探針的核苷酸序列為：

5'-CATTTTCTGGCGTTCTGTGCCTGGAATGATGNTGMNGAGACAGCAGGAT-3'，

其中，所述N代表任意核苷酸或任意修飾后的核苷酸，所述M代表具環狀結構的化合物；

2)在高嚴謹條件下可與1)所述的探針的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；

3)與1)、或2)所述的探針的核苷酸序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的核苷酸序列。

具體的，所述N代表攜帶有熒光素基團FAM的胸腺嘧啶脫氧核苷酸FAM-dT或攜帶有熒光淬滅基團BHQ的胸腺嘧啶脫氧核苷酸BHQ-dT，所述M代表四氫呋喃。

具體的，所述同源性為95％以上；再具體的為96％以上；再具體的為97％以上；再具體的為98％以上；再具體的為99％以上。

上述高嚴謹條件可為用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下雜交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

所述具有相同功能具體包括能用于檢測登革病毒的核苷酸序列。

具體的，所述探針的核苷酸序列為序列表中SEQ ID№：3所示核苷酸序列。

本發明的又一個目的是提供一種用于檢測登革病毒的組合物，所述組合物包括下述1)和2)：