[發明專利]一種檢測結直腸癌中蛋白質組的方法有效
| 申請號： | 201711004909.4 | 申請日： | 2017-10-25 |
| 公開（公告）號： | CN107860922B | 公開（公告）日： | 2019-09-17 |
| 發明（設計）人： | 李斌;胡會芳;何慶瑜 | 申請（專利權）人： | 暨南大學 |
| 主分類號： | G01N33/574 | 分類號： | G01N33/574;G01N27/62 |
| 代理公司： | 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245 | 代理人： | 向玉芳 |
| 地址： | 510632 廣東*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 檢測 直腸癌 蛋白質 方法 | ||
1.一種檢測結直腸癌中蛋白質組的方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)用Transwell法篩選細胞；
(2)用SILAC法標記細胞；
(3)用超濾管酶解蛋白樣品溶液；
(4)質譜數據生物信息學分析；
(5)生物信息學分析差異表達蛋白；
其中，步驟(1)的詳細步驟包括：
(i)用1×PBS潤洗細胞野生型HCT116和RKO細胞兩次，用0.05％的胰酶消化并收集下來，離心去除上清，用無血清培養基1640重懸細胞；
(ii)細胞計數，按照公式：按個/mL計，細胞密度＝(4個大格總數/4)×104×稀釋倍數；
(iii)取20×104個細胞加入Transwell實驗裝置的上室，用無血清DMEM培養基填補組間體積差異；
(iv)在Transwell實驗裝置的下室加入600μL培養液；
(v)置于37℃、5％CO2細胞培養箱內孵育72h；
(vi)遷移72h時，將穿過上室的細胞用胰酶消化下來，繼續培養，細胞量達到20×104后，重復步驟(i)，稱為1輪；每輪過后，時間會逐漸縮短，下室含的血清的濃度逐漸減少；
(vii)細胞篩選到第2～8輪后，做蛋白質的表型驗證。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(iv)加入含20％血清培養液；步驟(vii)的細胞篩選8輪，獲得I8細胞。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)的詳細步驟包括：
(i)在無菌的條件下操作，將SILAC Kit中每瓶培養基倒出50mL，再加入50mL透析過的胎牛血清；
(ii)將50mg13C6-L-賴氨酸二鹽酸鹽和50mg L-精氨酸鹽徹底溶解于10mL步驟(i)配置好的培養基中；(iii)用0.22μm的濾膜過濾除菌步驟(ii)溶解好的13C6-L-賴氨酸二鹽酸鹽和L-精氨酸鹽；
(iv)把過濾好的13C6-L-賴氨酸二鹽酸鹽和L-精氨酸鹽加入到490mL配置好的步驟(i)的培養基中，混勻，4℃保存，獲得重鏈培養基；
(v)再用10mL步驟(i)的培養基溶解50mg L-賴氨酸二鹽酸鹽和50mg L-精氨酸鹽，用0.22μm的濾膜過濾除菌，再加入到490mL的培養基中，混勻，4℃保存，獲得輕鏈培養基；
(vi)用重鏈培養基和輕鏈培養基分別培養HCT116細胞。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(vi)培養8代HCT116細胞。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)中肽段設置為7。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)數據分析后重復三次質譜，且差異倍數≥1.5或≤0.67，P<0.01，獲得差異蛋白。
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