[發明專利]一種快速獲取大鼠雜交瘤細胞單克隆抗體序列的測序方法及引物序列

在審

• 申請號: 201711004815.7
• 申請日: 2017-10-25
• 公開（公告）號: CN107779500A
• 公開（公告）日: 2018-03-09
• 發明（設計）人: 于海翔;根納季·格洛洛波夫;李競;陳智勝
• 申請（專利權）人: 上海藥明生物技術有限公司;無錫藥明康德生物技術股份有限公司;蘇州藥明康德檢測檢驗有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 上海浦一知識產權代理有限公司31211
• 代理人: 鄭權

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，尤其是涉及一種采用接頭序列用PCR產物直接測序的方法來特異性擴增大鼠雜交瘤細胞內抗體基因完整編碼序列的方法。

背景技術

RACE技術(rapid amplification of cDNA ends，RACE)是根據基因已知的部分序列擴增未知片段的方法。若要克隆編碼區的序列，需要先獲得5’端一側的未知序列，進而獲得完整的編碼序列。RACE技術是通過結合逆轉錄和PCR擴增基因未知片段的技術，已經成為擴增5’端未知基因完整編碼序列的最常用技術。基本原理：首先獲得包含目的基因mRNA的RNA樣品，并利用基因特異的引物進行逆轉錄，獲得目的基因相應的cDNA；在cDNA的3’末端(對應mRNA序列5’末端)加上特定的序列，通常將這段添加在cDNA上的特定序列稱為接頭(adaptor)，同時合成與adaptor序列相匹配的引物，稱為錨定引物；然后利用基因已知序列設計基因特異性引物，與錨定引物配對進行PCR擴增，得到未知部分的片段；再將擴增得到的片段測序，即可獲得目的基因未知部分的序列。

目前按接頭序列的添加方法可分為3大類：末端轉移酶法(terminal deoxynucleotidyl transferase method，TdT method)、接頭連接法(adaptor ligation)和寡核苷酸帽法(oligo caping method)。近年出現了一些可同時擴增編碼區3’一側與5’一側未知片段的技術，并推出了相應的試劑盒，如GeneRacer(Invitrogen公司)、SMART RACE(Takara-BD公司)等。這些技術的基本原理是用oligo(dT)起始逆轉錄，在完整mRNA逆轉錄所得的完整cDNA產物的3’端及5’端分別添加3’-adaptor及5’-adaptor，使所有完整的cDNA在兩端都帶有adaptor，成為包含所有基因信息的通用模板。再利用目的基因的特異引物與某一端的錨定引物搭配，則可利用同一份通用模板獲得不同基因、不同末端的未知序列。這兩種方法都需要先將逆轉錄產物進行純化，才能添加adaptor，而cDNA在純化過程中會發生損失，因此需要制備較大量的cDNA。雖然寡核苷酸帽法可以選擇性地對5’端完整的mRNA進行擴增，解決了末端轉移酶法和接頭連接法對mRNA完整性無選擇性的問題。但寡核苷酸帽法存在需要對RNA進行多步操作，在各步的酶反應之間又都需要對RNA進行純化，而且RNA很容易被降解，因此很容易損失掉大量的RNA，從而降低了此后RACE工作的效率，對于豐度較低的mRNA，甚至很難得到擴增產物。用通用模板作為起始材料，雖然可高通量地進行基因克隆，但是若僅需要通過5’-RACE擴增少數5’端未知基因編碼區的未知片段，通用模板并不適合。原因有如下2點：首先，通用模板的復雜性很高。通用模板對基因沒有選擇性，所有基因的完整cDNA均添加有adaptor，理論上包含所有基因對應的cDNA。在復雜的模板中，目的基因cDNA含量相對較低，對于表達豐度較低的基因，克隆難度則更大。而且，模板越復雜，PCR反應中越容易發生非特異擴增，影響目的片段在PCR反應中的擴增效率，非特異的擴增產物還會干擾目的條帶的選擇。其次，通用模板制備過程中，信息損失的可能性較大。這是因為，通用模板對RNA以及逆轉錄反應的完整性要求都很高，不完整mRNA的逆轉錄產物以及逆轉錄反應中鏈延伸不完全的cDNA都不會被添加adaptor；而逆轉錄反應的鏈延伸過程又很容易發生未成熟終止，若待延伸的mRNA模板較長，或具有較復雜的二級結構，則未成熟終止的可能性較大。

制備通用模板時逆轉錄反應需要從mRNA的3’末端一直延伸到5’末端，對于編碼區較長的基因，很難得到基因的完整cDNA。這些都會增加5’-RACE的工作量，并可能影響5’-RACE結果。此外，現有的所有5’-RACE方法中引物的設計和使用都受到強烈的限制。末端轉移酶法只能添加一串相同的核苷酸，通用模板只能使用同一套adaptor，接頭連接法和寡核苷酸帽法中的adaptor雖然可以自行設計，但由于鏈的長度影響連接反應的效率，因此也只能添加長度有限的adaptor(一般為15～30bp)。這樣就無法使用最適合于目的物種、目的基因的adaptor和相應的錨定引物，甚至模板中的部分基因序列中很可能含有錨定引物的非特異性結合位點。在PCR擴增時需要將錨定引物與基因特異引物搭配，研究人員就必須根據錨定引物的特點設計基因特異引物，這樣就會縮小基因特異引物的選擇范圍，最適合于目的基因的引物往往無法直接用于擴增。引物設計的靈活性有限，就使得研究人員需要花費較大工作量探討PCR條件，影響基因克隆效率。