[發明專利]一種快速獲取大鼠雜交瘤細胞單克隆抗體序列的測序方法及引物序列

在審

• 申請號: 201711004815.7
• 申請日: 2017-10-25
• 公開（公告）號: CN107779500A
• 公開（公告）日: 2018-03-09
• 發明（設計）人: 于海翔;根納季·格洛洛波夫;李競;陳智勝
• 申請（專利權）人: 上海藥明生物技術有限公司;無錫藥明康德生物技術股份有限公司;蘇州藥明康德檢測檢驗有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 上海浦一知識產權代理有限公司31211
• 代理人: 鄭權

1.一種快速獲取大鼠雜交瘤細胞單克隆抗體序列的測序方法，其特征在于，包括：

步驟1、為目的基因的cDNA添加接頭序列；

步驟2、用接頭序列和大鼠抗體可變區特異性引物通過PCR擴增大鼠雜交瘤細胞單克隆抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區；

步驟3、用PCR產物直接測定單克隆抗體序列。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1中的具體方法為：

1.1根據大鼠雜交瘤細胞單克隆抗體基因設計特異性逆轉錄引物，設計接頭序列，接頭序列3’末端有至少3個連續的鳥嘌呤；

1.2在逆轉錄體系中加入接頭序列和特異性逆轉錄引物，以接頭序列作為模板轉換引物，在逆轉錄即將完成時，接頭序列3’端的oligo(dG)會與cDNA末端的dC配對，具有末端轉移酶活性的逆轉錄酶則發生模板轉換，以接頭序列為模板繼續進行鏈延伸，從而得到3’端添加了接頭序列的單鏈cDNA片段。

3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟1.1中，所述接頭序列為5’-RACE接頭序列，該5’-RACE接頭序列為5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACACrGrGrGp-3’。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2中，以3’端添加了接頭序列的單鏈cDNA片段為模板，用目的基因的特異性引物進行巢式PCR擴增；對獲得的巢式PCR擴增片段進行電泳，切膠回收純化PCR產物。

5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，輕鏈根據恒定區抗原性的不同,分為kappa鏈和lambda鏈，

大鼠kappa輕鏈擴增引物為5’-AGGATGATGTCTTATGAACAA-3’(Rat-CK)；

大鼠lambda輕鏈擴增引物為5’-ACCATTTGCCTTCCAGGCCAC-3’(Rat-CL1)，5’-ACCATCTGCCTTCCAGACCAC-3’(Rat-CL2)兩條引物1:1的混合物；

大鼠重鏈擴增引物為5’-GCTGGACAGGGCTCCAGAGTTCC-3’(Rat-CHR)。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3中，對純化后的PCR產物進行測序，獲得目的基因3’末端至5’末端的序列，驗證后即得到5’端未知目的基因的完整編碼序列。

7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟3中，測序時，

大鼠重鏈測序引物為5’-GCTGGACAGGGCTCCAGAGTTCC-3’(Rat-CHR)；

大鼠kappa輕鏈測序引物為5’-AGGATGATGTCTTATGAACAA-3’(Rat-CK)；

大鼠lambda輕鏈測序引物為5’-ACCATTTGCCTTCCAGGCCAC-3’(Rat-CL1)，5’-ACCATCTGCCTTCCAGACCAC-3’(Rat-CL2)兩條引物1:1的混合物。

8.用于快速獲取大鼠雜交瘤細胞單克隆抗體序列的測序方法的PCR擴增引物，其特征在于，大鼠重鏈擴增引物為5’-GCTGGACAGGGCTCCAGAGTTCC-3’(Rat-CHR)；

大鼠kappa輕鏈擴增引物為5’-AGGATGATGTCTTATGAACAA-3’(Rat-CK)；

大鼠lambda輕鏈測序引物為5’-ACCATTTGCCTTCCAGGCCAC-3’(Rat-CL1)，5’-ACCATCTGCCTTCCAGACCAC-3’(Rat-CL2)兩條引物1：1的混合物。

9.用于快速獲取大鼠雜交瘤細胞單克隆抗體序列的測序方法的接頭引物，其特征在于，所述接頭序列3’末端有至少3個連續的鳥嘌呤，所述接頭序列為5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACACrGrGrGp-3’。