[發明專利]一種檢測肉牛KLF8基因CNV標記的方法及其應用

有效

• 申請號: 201711003896.9
• 申請日: 2017-10-24
• 公開（公告）號: CN107619857B
• 公開（公告）日: 2020-06-16
• 發明（設計）人: 黃永震;張靜;鄭立;賀花;徐嘉威;文逸凡;張子敬;黨瑞華;藍賢勇;雷初朝;陳宏;胡沈榮
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 范巍

本發明公開了一種檢測肉牛KLF8基因CNV標記的方法及其應用：以肉牛品種郟縣牛的血液全基因組DNA為模板，通過實時熒光定量PCR方法分別擴增其KLF8基因CNV區域和內參基因BTF3，根據2*log₂ 2^?ΔΔCt將結果分為插入型、缺失型和正常型，鑒定其KLF8基因的拷貝數變異。與郟縣牛生產數據的關聯分析顯示，KLF8不同拷貝數對郟縣牛的生長發育有顯著影響，其中缺失型個體的胸寬顯著高于插入型和正常型個體。本發明在DNA水平上檢測與肉牛生產性狀密切相關的CNV，可作為肉牛生長性狀的標記輔助選擇的重要候選分子標記，快速建立遺傳資源優良的肉牛種群。

技術領域

本發明涉及家畜分子生物學檢測領域，具體涉及一種基于QPCR技術檢測肉牛KLF8基因CNV標記的方法。

背景技術

隨著基因組學和生物信息學等學科的迅猛發展，動物育種理論和技術正在發生重大變化，肉牛育種的方向由常規的表型選育向分子育種發展。目前，牛分子育種研究主要集中在以分子標記為基礎的標記輔助選擇方面。分子育種，即分子標記輔助選擇(molecularmark-assist selection,MAS)，該技術是借助DNA分子標記對遺傳資源或育種材料進行選擇，對畜禽的綜合性狀進行品種改良。在畜禽育種中，通過對生長性狀密切相關，并且與數量性狀緊密關聯的DNA標記的選擇，達到早期選種和提高育種值準確性的目的，從而在畜禽育種中獲得更大的遺傳進展。

拷貝數變異(Copy Number Variations,CNVs)，作為一種新發現的基因組亞顯微水平結構變異類型，是指基因組DNA中較大片段的缺失或重復現象，涉及的片段大小在50bp到數Mb之間，包括拷貝數增加(Copy number gain)和拷貝數減少(Copy number loss)。

全基因組范圍內尋找CNV的方法主要有比較基因組雜交(CGH)、SNP芯片和重測序，其中前兩種主要基于芯片技術。(1)CGH技術是基于微陣列技術的比較基因組雜交，通過在一張芯片上用標記不同熒光素的樣品(試驗樣本與對照樣本)同時進行雜交可檢測試驗樣本基因組和對照基因組間DNA拷貝數的變化。CGH芯片的探針覆蓋整個基因組，所以這種分析方法是高通量分析法，且具有敏感度、準確度、分辨率高的特點，分析所得的試驗數據有較高的可信度。然而該技術分辨率在Mb水平，更小片段的拷貝數片段則不易檢出。同時該技術操作繁瑣，耗時長且成本昂貴，需要較為大量的模板DNA，不利于大范圍的推廣。(2)SNP芯片不需要同時使用兩個樣本的DNA和探針進行雙雜交，僅使用單雜交就可以完成。它可以通過比較測試樣本的信號強度與其他個體的強度，而確定每個位點的相對基因組拷貝數。(3)重測序利用新一代直接測序技術克服了雜交固有的一些缺點，不需要知道更多的背景知識和設計工作，應用配對測序可以鑒定出復雜的結構變化。

對于已確定的CNV的檢測，通常是采用基于PCR技術和雜交技術的一些方法。例如QPCR、QMPSF、MLPA、FISH、Southern blotting和MAPH。其中，實時熒光定量PCR(QPCR)最為常用。根據QPCR所使用的熒光化學方法的不同，主要分為熒光染料嵌入法和熒光雜交探針法兩類。PCR反應體系中加入過量的SYBR Green染料分子，能特異性地滲入DNA雙鏈并發射熒光信號，而游離的染料分子則僅有很低的熒光本底幾乎不發光，從而確保信號的增加與PCR產物的增加同步，可通過檢測熒光信號的強度來反映基因組DNA的數量。通過對目的基因(具有拷貝數變異)及參考基因(無拷貝數變異)進行相對定量，根據2^-ΔΔCt方法統計檢測樣本候選基因的拷貝數。染料法的優點是實驗成本低、無需設計合成探針、使用方便，可以檢測目的片段的絕對拷貝數，但不適用于大樣本的高通量檢測。

KLF8(Krüppel-like factor 8)基因是屬于KLFs(Krüppel-like factors)家族中的一種轉錄因子。KLF8基因廣泛表達于機體的各組織器官中，其在細胞周期的調控、EMT的激活、表達的作用都與癌癥的發生發展有著密不可分的聯系，而在脂肪細胞分化中的作用為調控生長發育提供基礎。