[發明專利]一種地衣芽孢桿菌與酪酸菌復合菌劑的制備方法在審

申請號：	201711002881.0	申請日：	2017-10-24
公開（公告）號：	CN107557322A	公開（公告）日：	2018-01-09
發明（設計）人：	胡紅偉;段明房;麻嘯濤;閆凌鵬;楊京娥;黨亞鵬	申請（專利權）人：	山西大禹生物工程股份有限公司
主分類號：	C12N1/20	分類號：	C12N1/20;C12R1/10;C12R1/07
代理公司：	太原高欣科創專利代理事務所(普通合伙)14109	代理人：	冷錦超,崔雪花
地址：	044600 山西***	國省代碼：	山西;14
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種地衣芽孢桿菌酪酸復合制備方法
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及生物發酵技術領域，具體涉及補料分批發酵制備地衣芽孢桿菌與酪酸菌復合菌劑的方法。

背景技術

由于目前飼料中添加抗生素的現象十分普遍，出于安全原因，許多國家禁止利用一些畜產品下腳料生產的肉骨粉等動物蛋白原料用于飼料，因此，從安全與成本角度考慮，將植物源蛋白作為動物蛋白原料的替代品已經成為一種趨勢。但是，要高效利用植物源蛋白，需要解決影響消化吸收的抗營養因子、適口性等問題；同時在幼禽畜養殖防治下痢中，抗生素的使用嚴重威脅了我們的食品安全，因此，在飼料生產中，需要采用在功能上能夠替代不良副作用添加劑的微生態添加劑產品。然而傳統固態發酵復合菌固態發酵過程中，多菌種同時接種無法同時滿足不同菌發酵要求，造成發酵不徹底。多菌種組合固態整體發酵的關鍵控制點在于把握和控制好好氧與厭氧二個階段，掌握好好氧向厭氧的轉換。

公布號 CN 103478417 A提供了一種二次接種分段固態發酵生產發酵豆粕的方法，將枯草芽孢桿菌液、假絲酵母菌液和乳酸桿菌液混合得到的混合菌液接入到去皮豆粕，混合發酵；將乳酸桿菌液接入到發酵物中，混合，厭氧發酵，得到發酵豆粕。該方法能夠滿足好氧菌與厭氧菌的不同需求，可生產制備高品質的發酵豆粕。雖然該專利也考慮到了不同菌種發酵的條件，但是菌種的種類是影響復配和發酵條件的關鍵因素，對于地衣芽孢桿菌和酪酸菌的復配沒有相關的技術啟示。

地衣芽孢桿菌細胞形態和排列呈桿狀、單生，屬革蘭氏陽性好氧菌，生長過程中可迅速消耗環境中的游離氧氣，在腸道創造一個厭氧環境，促進腸道益生菌(乳酸菌、雙歧桿菌及丁酸梭菌等)的生長，可促使機體產生抗菌活性物質、殺滅致病菌。地衣芽孢桿菌具有較強的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性，能夠降解飼料中的抗營養因子，地衣芽孢桿菌形成芽孢后具有抗逆性強、耐熱、存儲時間長等優點。

酪酸菌，又名丁酸梭菌，是梭狀芽孢桿菌屬的其中一種，存在于奶酪、天然酸奶、土壤及人和動物糞便中，是人和動物腸道的正常菌群。丁酸梭菌是一種厭氧的革蘭氏陽性芽孢桿菌，菌體呈直或者彎形，單個或成對、短鏈，有鞭毛可運動，菌體可形成芽孢，芽孢偏心或次端生(內生)，呈圓形或橢圓形，無胞外壁和附屬絲。丁酸梭菌通過消化道時，能夠耐胃酸及膽鹽的惡劣環境，是調節動物腸道微生態平衡的有益菌。

由于酪酸菌是一種嚴格厭氧菌，單獨生產的話，需要通過石蠟油、氮氣或二氧化碳等維持的厭氧環境來生產，設備要求較高，生產成本大；而地衣芽孢桿菌屬于好氧菌，采用聯合培養的方式，常常導致出現兩種菌都生長不穩定或嚴重退化的現象。

發明內容

本發明的目的在于克服單菌培養過程中生產周期長、設備要求高等缺點，提供一種將兩段式系統發酵工藝，將好氧菌與厭氧菌協同發酵，地衣芽孢桿菌能夠為酪酸菌提供厭氧環境和豐富的營養物質，加快了后期酪酸菌的生長速度，同時采用補料分批發酵，提高了菌體密度，簡化生產工藝，大大提高生產效率。

本發明所采用的技術方案為：一種地衣芽孢桿菌與酪酸菌復合菌劑的制備方法，包括菌種的活化及擴配、種子罐培養、發酵罐培養、菌體離心收集、載體吸附及低溫干燥，具體為：

1、菌種活化及擴大培養。

（1）地衣芽孢桿菌：

a）菌種活化：取地衣芽孢桿菌甘油管菌種，接種到牛肉膏蛋白胨液體培養基中，120~160 r/min，30~37℃培養24h，牛肉膏蛋白胨平板計數。

b）菌種擴配：挑選牛肉膏蛋白胨平板計數上的單菌落，接種牛肉膏蛋白胨液體培養基中，30~37℃，120~160 r/min振蕩培養24h。

（2）酪酸菌：

a）菌種活化：取酪酸菌甘油管菌種，接種到相應的種子培養基中，32~37℃厭氧培養12~18h，RCM平板計數。

b）菌種擴配：挑選RCM平板上的單菌落，接種于RCM液體培養基中，置于厭氧袋中，37℃厭氧培養24h。

2、種子罐培養菌種。