[發明專利]一種檢測JAK2V617F基因突變的引物組合物及其試劑盒和檢測方法

在審

• 申請號: 201711002034.4
• 申請日: 2017-10-24
• 公開（公告）號: CN107841536A
• 公開（公告）日: 2018-03-27
• 發明（設計）人: 關明;曹國君;許笑;唐宜桂;張心菊;康志華;鄧萱;馬瑋哲;王儼;馬艷春
• 申請（專利權）人: 復旦大學附屬華山醫院
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 上海申新律師事務所31272
• 代理人: 竺路玲

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，尤其涉及一種檢測JAK2 V617F基因突變的引物組合物及其試劑盒和檢測方法。

背景技術

經典的骨髓增殖性腫瘤(myeloproliferative neoplasm，MPN)是一組以一系或多系成熟血細胞擴增為特征的克隆性疾病，包括真性紅細胞增多癥(polycythemia vera，PV)、原發性血小板增多癥(essential thrombocythemia，ET)和原發性骨髓纖維化(primary myelofibrosis，PMF)，可造成嚴重貧血、急性白血病轉化等，血栓是最常見的并發癥，也是MPN患者的主要致死原因。

PV是一種克隆性的以紅細胞異常增殖為主的慢性骨髓增生性疾病，患者表現為紅細胞大量增殖，影響氧的運輸，血清促紅細胞生成素水平低于正常下限，骨髓活檢顯示增生活躍，易合并出血及血栓性并發癥和脾腫大。ET患者表現為持續性的血小板升高(>450×10⁹/L)，巨核細胞增生，脾腫大，容易發生血栓或出血。PMF是以骨髓中巨核細胞和粒細胞顯著增生伴反應性纖維化，巨核細胞發育異常為特征，近20％的患者最后演變為急性白血病，死因多為嚴重貧血、充血性心力衰竭、出血或反復感染、急性白血病轉化等。此三類疾病之間可互相轉化或合并存在，由于患者血細胞過度增殖而引起血液淤滯，從而可誘發各種心腦血管疾病。

PV、PMF和ET的常規診斷主要根據臨床表現、實驗室檢查和病理形態學分析進行綜合判斷。由于反應性增生與MPN同樣具有外周血細胞計數增加的實驗室檢查特征，加之MPN的臨床癥狀不典型，對于不同類型的MPN與反應性增生之間的鑒別診斷一直是困擾臨床的問題。在過去的近半個世紀，有關經典的骨髓增殖性腫瘤研究發展緩慢，幾乎是一個被血液學界遺忘的角落，自2005年JAK2 V617F突變被發現以來，特別是近年隨著二代測序技術在臨床的推廣應用，MPN特異性的基因突變譜系得以被揭示，為經典的骨髓增殖性腫瘤的診斷、預后和治療策略制定提供了全新的分子標志物[5]。

2005年，國際上多個研究小組幾乎同時發現了在MPN患者的骨髓和外周血中存在JAK2 V617F點突變，此突變是位于JAK2基因14外顯子1849位堿基G>T點突變，通過將617號密碼子的纈氨酸置換為苯丙氨酸影響JH2結構域的活性，并導致JAK2自主抑制功能失調，在沒有細胞因子刺激的條件下使JAK2仍能被激活并促進造血細胞增殖。

JAK2V617F在MPN的突變率分別為：PV 95％，ET 50％～60％，PMF 50％～60％，但至今尚無在淋巴細胞疾病、實體腫瘤和反應性骨髓增殖性病變中出現JAK2 V617F突變的報道，因此現認為JAK2 V617F突變的發現對MPN的診斷是革命性的突破。JAK2 V617F突變發現一年之后，在該突變陰性的ET和PMF患者中發現了骨髓增生性白血病病毒致癌基因(MPL)突變，但PV患者未發現有此突變。MPL基因位于染色體1p34，編碼血小板生成素受體并影響巨核細胞的增殖及分化。MPL突變是位于MPL基因10號外顯子515位密碼子色氨酸TGG置換為亮氨酸TTG(515L)或色氨酸TGG替換為賴氨酸AAG(515K)。約5％～10％的ET/PMF患者攜帶MPL突變，MPL 515突變已經成為ET和PMF分子標志物。

目前，JAK2 V617F、MPL W515K/L突變已被WHO納入了此類疾病的主要診斷標準，這些分子標志物的發現不僅有助于MPN的診斷和鑒別診斷，還有助于判斷臨床轉歸和預后。如JAK2 V617F突變負荷越高，患者年齡越大，血紅蛋白水平和白細胞計數則越高，血小板計數越低，脾大和皮膚瘙癢也越明顯。隨著JAK2 V617F突變負荷增高，PV和ET患者發生血栓和繼發ET、PV后的骨髓纖維化的概率也顯著增高。近年來，越來越多的分子標志物，如MPL、TET和CALR突變等相繼被發現，這些標志物的發現對于理解MPN的分子發病機制具有重要意義，也有助于對這類疾病的患者進行診斷和治療。