[發明專利]一種利用納米材料細胞傳感器評價抗氧化多肽活性的方法

有效

• 申請號: 201711001448.5
• 申請日: 2017-10-24
• 公開（公告）號: CN107796856B
• 公開（公告）日: 2019-08-30
• 發明（設計）人: 張萬剛;邢路娟;葛慶豐
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/00
• 分類號: C12Q1/00
• 代理公司: 揚州市蘇為知識產權代理事務所(普通合伙) 32283
• 代理人: 周全;陳彩霞

技術領域

本發明涉及抗氧化能力測定領域，具體涉及一種基于細胞傳感器對多肽的抗氧化活性評價新方法。以結腸腺癌細胞為感應原件，構建細胞凝膠三維網絡結構，并結合納米材料修飾電極，對多肽的抗氧化活性展開評定。

背景技術

自由基是生物體在正常新陳代謝中產生的活性分子，它既是生物體代謝過程中必不可少的信號分子，但過多的自由基又會對生物體的正常生理功能產生影響。有研究表明，生物體的衰老、病變等均與自由基的氧化損傷有關。在正常的代謝環境下，生物體內的自由基可以經抗氧化酶系統及非酶類抗氧化介質代謝清除，從而降低了自由基氧化帶來的機體損傷。同時，通過飲食攝入抗氧化類物質如：多酚、黃酮、多肽等均可以起到良好的自由基清除作用，從而減少生物大分子及細胞氧化損傷的發生。近年來，以動物蛋白為原料，通過天然降解或外源酶添加的辦法從中提取抗氧化多肽的研究報道屢見不鮮。同時，以體外化學方法檢測抗氧化類物質的自由基清除、金屬離子螯合及抑制脂質氧化的活性，成為評價抗氧化類物質功能特性的常用手段。化學檢測多采用單線態自由基產生及猝滅原理，通過測定自由基反應前后的氧化物質變化進一步反應抗氧化活性的強弱。此方法雖然簡易操作，但單一的體外實驗并不能完全說明抗氧化物質在細胞及生物體內的作用；而采用動物試驗檢測抗氧化活性的方法周期過長，不利用實現短時間內的有效評價。因此，為了實現抗氧化多肽的進一步應用，實現抗氧化活性的快速有效及可靠性檢測成為目前急需解決的重要課題。

發明內容

本發明針對以上問題，提供了一種納米材料細胞傳感器，并利用該傳感器對抗氧化多肽的活性進行評價。該傳感器以納米材料改良電極，以結腸腺癌細胞作為傳感介質，以電化學阻抗為指標，實現了抗氧化多肽在細胞層面的抗氧化作用評價，打破了常規化學檢測的局限性，進一步擴展了抗氧化類物質的評價方法，為模擬抗氧化類物質的體內生物活性及功能提供了基礎。

本發明的技術方案是：

一種納米材料細胞傳感器，包括裸金電極，以及固定在裸金電極上的納米鉑粒子、納米銀線和結腸癌細胞Caco-2。

一種納米材料細胞傳感器的制備方法，包括如下步驟：

a)、納米鉑粒子的電鍍：將打磨后的裸金電極置于8～12mM的H₂PtCl₆溶液中，在電壓-0.3～-0.1V，掃描速率100～200mV/s的條件下電鍍250～350s；

b)、納米銀線的修飾：將納米銀線溶解在去離子水中，然后滴加到鍍鉑的電極上，經10～15min日光燈照射，使納米銀線固定在電極表面得到納米修飾電極；

c)、凝膠的制備：將海藻酸鈉添加至濃度為1×的DMEM培養液中，添加量為0.01～0.02g/mL，超聲處理4～6min，使海藻酸鈉均勻分布在DMEM培養液中；再將氧化石墨烯溶液至均布了海藻酸鈉的DMEM培養液中，添加量為1.20～1.30mg/mL，均勻攪拌后采用超聲波處理25～35min除氣泡混勻；

d)、Caco-2細胞的培養：在37℃、CO₂含量為5％的環境中，于含有體積濃度為8～13％的胎牛血清的DMEM培養基中培養結腸癌細胞Caco-2，培養5-6天，隔天換液；

e)、細胞固定：將含有Caco-2細胞的DMEM懸浮液與凝膠按照1:1的體積比例混合，輕輕攪拌后吸取4～6μL滴加在納米修飾電極的表面，接著將細胞電極浸沒于CaCl2溶液中進行固定2～4min，制備得到納米材料細胞傳感器。

所述步驟e)中Caco-2細胞細胞以2×10⁶/mL的濃度與凝膠等體積混勻。

一種利用納米材料細胞傳感器評價抗氧化多肽活性的方法，包括如下步驟：

1)、納米鉑粒子的電鍍：將打磨后的裸金電極置于8～12mM的H₂PtCl₆溶液中，在電壓-0.3～-0.1V，掃描速率100～200mV/s的條件下電鍍250～350s；

2)、納米銀線的修飾：將納米銀線溶解在去離子水中，然后滴加到鍍鉑的電極上，經10～15min日光燈照射，使納米銀線固定在電極表面得到納米修飾電極；

3)、凝膠的制備：將海藻酸鈉添加至濃度為1×的DMEM培養液中，添加量為0.01～0.02g/mL，超聲處理4～6min，使海藻酸鈉均勻分布在DMEM培養液中；再將氧化石墨烯溶液至均布了海藻酸鈉的DMEM培養液中，添加量為1.20～1.30mg/mL，均勻攪拌后采用超聲波處理25～35min除氣泡混勻；