[發(fā)明專利]一種利用納米材料細(xì)胞傳感器評價(jià)抗氧化多肽活性的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711001448.5
• 申請日: 2017-10-24
• 公開（公告）號: CN107796856B
• 公開（公告）日: 2019-08-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張萬剛;邢路娟;葛慶豐
• 申請（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/00
• 分類號: C12Q1/00
• 代理公司: 揚(yáng)州市蘇為知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32283
• 代理人: 周全;陳彩霞

1.一種納米材料細(xì)胞傳感器，其特征在于，包括裸金電極，以及固定在裸金電極上的納米鉑粒子、納米銀線和結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2。

2.一種權(quán)利要求1所述的納米材料細(xì)胞傳感器的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

a)、納米鉑粒子的電鍍：將打磨后的裸金電極置于8～12mM的H₂PtCl₆溶液中，在電壓-0.3～-0.1V，掃描速率100～200mV/s的條件下電鍍250～350s；

b)、納米銀線的修飾：將納米銀線溶解在去離子水中，然后滴加到鍍鉑的電極上，經(jīng)10～15min日光燈照射，使納米銀線固定在電極表面得到納米修飾電極；

c)、凝膠的制備：將海藻酸鈉添加至濃度為1×的DMEM培養(yǎng)液中，添加量為0.01～0.02g/mL，超聲處理4～6min，使海藻酸鈉均勻分布在DMEM培養(yǎng)液中；再將氧化石墨烯溶液至均布了海藻酸鈉的DMEM培養(yǎng)液中，添加量為1.20～1.30mg/mL，均勻攪拌后采用超聲波處理25～35min除氣泡混勻；

d)、Caco-2細(xì)胞的培養(yǎng)：在37℃、CO₂含量為5％的環(huán)境中，于含有體積濃度為8～13％的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2，培養(yǎng)5-6天，隔天換液；

e)、細(xì)胞固定：將含有Caco-2細(xì)胞的DMEM懸浮液與凝膠按照1:1的體積比例混合，輕輕攪拌后吸取4～6μL滴加在納米修飾電極的表面，接著將細(xì)胞電極浸沒于CaCl2溶液中進(jìn)行固定2～4min，制備得到納米材料細(xì)胞傳感器。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種權(quán)利要求1所述的納米材料細(xì)胞傳感器的制備方法，其特征在于，所述步驟e)中Caco-2細(xì)胞細(xì)胞以2×10⁶/mL的濃度與凝膠等體積混勻。

4.一種利用權(quán)利要求1所述的納米材料細(xì)胞傳感器評價(jià)抗氧化多肽活性的方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)、納米鉑粒子的電鍍：將打磨后的裸金電極置于8～12mM的H₂PtCl₆溶液中，在電壓-0.3～-0.1V，掃描速率100～200mV/s的條件下電鍍250～350s；

2)、納米銀線的修飾：將納米銀線溶解在去離子水中，然后滴加到鍍鉑的電極上，經(jīng)10～15min日光燈照射，使納米銀線固定在電極表面得到納米修飾電極；

3)、凝膠的制備：將海藻酸鈉添加至濃度為1×的DMEM培養(yǎng)液中，添加量為0.01～0.02g/mL，超聲處理4～6min，使海藻酸鈉均勻分布在DMEM培養(yǎng)液中；再將氧化石墨烯溶液至均布了海藻酸鈉的DMEM培養(yǎng)液中，添加量為1.20～1.30mg/mL，均勻攪拌后采用超聲波處理25～35min除氣泡混勻；

4)、Caco-2細(xì)胞的培養(yǎng)：在37℃、CO₂含量為5％的環(huán)境中，于含有體積濃度為8～13％的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2，培養(yǎng)5～6天，隔天換液；

5)、細(xì)胞處理：

5.1)、空白對照組：細(xì)胞按照1×10⁵接種至細(xì)胞板上，待細(xì)胞生長完全填充細(xì)胞板內(nèi)底，用PBS清洗細(xì)胞2～3次，添加胰酶消化，收集細(xì)胞得到細(xì)胞懸浮液一；

5.2)、氧化損傷組：細(xì)胞按照1×10⁵接種至細(xì)胞板上，待細(xì)胞生長完全填充細(xì)胞板內(nèi)底，添加H₂O₂氧化損傷2～3h，然后用PBS清洗細(xì)胞2～3次，添加胰酶消化，收集細(xì)胞得到細(xì)胞懸浮液二；

5.3)、多肽處理組：細(xì)胞按照1×10⁵接種至細(xì)胞板上，待細(xì)胞生長完全填充細(xì)胞板內(nèi)底，添加溶解有多肽的DMEM溶液預(yù)處理10～12h后添加H₂O₂氧化損傷2～3h，然后用PBS清洗細(xì)胞2～3次，添加胰酶消化，收集細(xì)胞得到細(xì)胞懸浮液三；

6)、細(xì)胞固定：將細(xì)胞懸浮液一、細(xì)胞懸浮液二、細(xì)胞懸浮液三分別與凝膠按照1:1的體積比例混合，混勻后分別吸取4～6μL滴加在修飾電極一、修飾電極二、修飾電極三的表面得到細(xì)胞電極一、細(xì)胞電極二和細(xì)胞電極三，然后將細(xì)胞電極一、細(xì)胞電極二和細(xì)胞電極三分別浸沒于CaCl₂溶液中固定2～4min，最后置于5％CO₂的37℃培養(yǎng)箱孵育3～6min，取出得到細(xì)胞傳感器一、細(xì)胞傳感器二和細(xì)胞傳感器三；

7)、電化學(xué)檢測：在含有1.0mM的Fe(CN)₆^3-/4-溶液中分別對細(xì)胞傳感器一、細(xì)胞傳感器二和細(xì)胞傳感器三進(jìn)行電化學(xué)方法檢測，記錄電流信號并分別讀取峰值電流記為I，I_o，I_p；

8)、判斷多肽是否具有抗氧化性：

8.1)、當(dāng)I_o＞I時(shí)，說明細(xì)胞傳感器有效，進(jìn)而進(jìn)入步驟8.2)評價(jià)多肽的抗氧化性；

8.2)、當(dāng)I≤Ip≤I_o時(shí)，說明該多肽有抗氧化性，當(dāng)I_o≤Ip時(shí)，說明該多肽沒有抗氧化性。