[發(fā)明專利]基于磁富集的熒光定量高靈敏可視化聯(lián)檢免疫層析試紙條的制備和檢測方法

有效

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• 申請日: 2017-10-24
• 公開（公告）號: CN107677806B
• 公開（公告）日: 2019-08-20
• 發(fā)明（設計）人: 常津;張博;宮曉群;高瑋辰
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N33/558;G01N33/574
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 王麗

本發(fā)明涉及基于磁富集的熒光定量高靈敏可視化聯(lián)檢免疫層析試紙條的制備和檢測方法；利用高分子聚乳酸?羥基乙酸共聚物通過超聲乳化法多包裹Fe₃O₄磁性納米顆粒，可使靶物質迅速有效地結合到磁性微球上，新生成的復合物在磁場中磁響應性相同，用來富集待檢樣本，增強檢測靈敏度，同時實現(xiàn)聯(lián)合檢測，依托免疫層析試紙條檢測平臺，進行雙抗夾心免疫反應，并通過磁納米顆粒在特定條件下可以淬滅熒光信號的反應機理，達到裸眼條件下快速定性，暗場測試下精準定量的寬范圍雙模態(tài)檢測，同時應用磁納米顆粒的超順磁性富集待檢血清,通過對乳腺癌腫瘤標志物CEA和CA153的聯(lián)合檢測來提高乳腺癌早期診斷的準確性及社區(qū)篩查的普適性。

技術領域

本發(fā)明涉及醫(yī)藥診斷技術領域，更具體的是涉及一種基于磁富集的熒光定量高靈敏可視化聯(lián)檢免疫層析試紙條的制備和檢測方法。

背景技術

乳腺癌是現(xiàn)代女性最常見最多發(fā)的一種惡性腫瘤，目前已占婦女惡性腫瘤發(fā)病率的首位，并且發(fā)病率每年都在遞增，據(jù)統(tǒng)計，在大多數(shù)發(fā)達國家中，惡性腫瘤在居民死亡原因中居首位或第二位。其中乳腺癌的發(fā)病率位居國內八大癌癥第五，在經(jīng)濟快速發(fā)展的同時，乳腺癌病人也在突飛猛進”。乳腺癌術后是否發(fā)生遠處轉移是決定患者生存時間的主要因素，早發(fā)現(xiàn)、早診斷及早治療是延長患者生存時間、降低病死率的關鍵。然而腫瘤轉移的診斷依靠腫瘤擴散的臨床表現(xiàn)或者圖像分析，往往為時已晚。因此需要一種敏感性較高的診斷方法來協(xié)助臨床醫(yī)生判斷術后是否出現(xiàn)轉移，這將直接關系到患者的后期治療和生存時間。目前腫瘤標志物的研究有助于盡早發(fā)現(xiàn)術后是否轉移，并且將理想的乳腺癌腫瘤標志物用于治療療效評價和預后評估，將有很高的臨床應用價值。

乳腺癌抗原(CA153)是一種大分子粘液性糖蛋白，主要存在于乳腺上皮管腔面細胞膜上，當細胞惡變時，血清水平明顯升高，是目前應用最普遍的對乳腺癌較為特異的一項腫瘤標志物，其含量的變化與治療效果密切相關，是診斷乳腺癌和監(jiān)測術后轉移、觀察療效的最佳指標。癌胚抗原(CEA)是一種酸性糖蛋白，是一種廣譜腫瘤標志物，有文獻表明血清CEA在晚期乳腺癌陽性率可高達71.43％，在乳腺癌有遠處轉移現(xiàn)象發(fā)生的患者中出現(xiàn)CEA含量升高的比例高達50％—70％。目前單一腫瘤標志物的相關報道和研究已有很多，但單獨檢測用于乳腺癌的診斷靈敏度較低，臨床上常采用聯(lián)合檢測多種腫瘤標志物來提高檢測的靈敏度。因此，同時將CA153和CEA作為腫瘤標志物，對高危人群進行篩查，對乳腺癌的早期診斷、病情發(fā)展和預后監(jiān)測等工作將大有幫助。因此，對生物體內的腫瘤標志物實現(xiàn)高靈敏度的檢測是生命科學領域研究的一項重要課題，發(fā)展一種新的高靈敏的檢測方法也是目前研究者們努力的目標。

試紙條技術是一種操作簡單，無需專業(yè)培訓，方便快捷，結果直觀的免疫學檢測技術。其檢測原理是將特異的抗體(或抗原)作為捕獲試劑固定于硝酸纖維素膜的特定區(qū)域，加入待測樣品后，在毛細作用力的推動下，待測樣品沿著膜向前移動，當移動至固定有捕獲試劑的區(qū)域時，樣品中的抗原(或抗體)與捕獲試劑發(fā)生特異性結合，標記試劑則顯示出一定的顏色從而實現(xiàn)特異性檢測的免疫分析方法。目前已經(jīng)商品化的免疫層析試紙條多用膠體金作為標記物，雖然檢測結果通過肉眼可見，但無法完成精準定量檢測，且抗原濃度略高于臨界值的樣本檢測條帶顏色太淺往往無法用肉眼識別；熒光免疫層析試紙條檢測技術是膠體金免疫層析試紙條技術后為實現(xiàn)定量檢測興起的新技術，但在研究過程中發(fā)現(xiàn)，背景熒光是限制熒光免疫層析技術檢測靈敏度的一個重要因素，這其中包括來自硝酸纖維素膜和樣品本身的自發(fā)熒光。因此如何降低熒光免疫層析檢測中背景熒光的影響，成為了提高熒光免疫層析試紙條檢測技術靈敏度亟需解決的課題。