[發明專利]可誘導的轉基因小鼠心肌病動物模型的構建方法及應用

有效

• 申請號: 201711001389.1
• 申請日: 2017-10-24
• 公開（公告）號: CN108018310B
• 公開（公告）日: 2020-07-28
• 發明（設計）人: 彭天慶;黃一帆;曹婷;鄭東;張露露
• 申請（專利權）人: 蘇州大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;C12N15/70;A01K67/027
• 代理公司: 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙) 32257
• 代理人: 馮瑞

本發明涉及一種含有calpain?1基因的表達載體，包括依次連接的Tet操縱子、α?MHC啟動子核酸序列、線粒體信號肽序列以及calpain?1的基因片段。本發明還提供了一種可誘導的轉基因小鼠心肌病動物模型的構建方法：將含有calpain?1基因的表達載體導入小鼠受精卵，然后將受精卵移入受體小鼠子宮進行妊娠，獲得陽性子代轉基因小鼠；將陽性子代轉基因小鼠與特異性表達tTA的轉基因小鼠或特異性表達rtTA的轉基因小鼠交配，從雜交子代中挑選出可誘導的轉基因小鼠心肌病動物模型。本發明還公開了上述構建方法得到的轉基因小鼠心肌病動物模型在篩選治療心肌病藥物的應用。本發明的建模成功率高，表型穩定，成本較低，可根據實際需要選擇是否誘導心肌病的發生。

技術領域

本發明涉及轉基因技術領域，尤其涉及一種可誘導的轉基因小鼠心肌病動物模型的構建方法及應用。

背景技術

心肌病是一類由多種原因引起的，以心肌增大、增厚和變硬為主要特征的心肌疾病，臨床上常表現為心臟機械/心電活動障礙和心室異常肥厚或擴張，該病隨病程發展可最終演變成心力衰竭。近些年來，心肌病發病率在全球逐年上升，在我國也已經成為臨床最常見的心臟病之一。心肌病發病機制復雜、病程隱匿、預后極差并缺乏特效治療手段，嚴重危害人群健康的同時也給國家和社會造成沉重負擔。心肌病動物模型在相關研發過程中扮演著重要角色，同時兼具經濟、可靠和簡便易得等特性的心肌病動物模型能在很大程度上節約人力、物力和財力，加速推動研發過程。

目前常見的心肌病動物模型建模方式主要有以下幾種：

1.病毒感染。具體是向健康動物的腹腔注射柯薩奇病毒3(CVB3)，根據接種量的不同約在1-3個月后發展為心肌病。CVB3感染所致的心肌病模型與臨床關聯性較好，能夠比較好地模擬病毒所致擴張性心肌病的發生發展過程。這種方式的缺點：(1)建模時間偏長，有文獻報道最長需1年以上；(2)病毒本身使用過程中存在很大的潛在風險；(3)在建模過程中心肌炎和心肌病的界限不易準確鑒別，可行性較差。

2.右室超速起搏。向健康動物的心臟右室前壁放置起搏器誘導心肌病，采用此種方法建立的心肌病模型與臨床具有一定相關性。但缺點如下：(1)需要有一定的技術訓練和配套設備；(2)小型動物例如大、小鼠心臟小，操作極為不便，失敗率較高。

3.藥物干預。阿霉素是一種直接作用于DNA的藥物，臨床上用來治療多種腫瘤，由于其具有心肌損傷的毒副作用，因此也可用來制備心肌病動物模型。通常是向健康動物一次性高劑量或連續多次低劑量腹腔注射阿霉素，連續通過超聲心動圖做心功能檢測直至確定心肌病造模成功。隨著藥物劑量的增加和作用時間的延長，可引起擴張性心肌病，病理可見心肌細胞腫脹、間隙變小、心肌纖維局限性斷裂和心肌間質中血管擴張等變化，心功能方面則出現左室射血分數和左室短軸縮短率等多項指標顯著下降，這些病理形態學方面和心功能方面的改變與臨床心肌病較為接近。這種方式的缺點：(1)阿霉素使用劑量目前尚無統一標準，劑量不足容易造模失敗而劑量過高容易直接致死；(2)腹腔注射需要有一定的技術訓練，實際操作過程中由于操作人員的手法差異，存在著一定的失敗率。

4.引進模型。直接引進心肌病動物模型，例如BIO 14.6地鼠，該品系動物存在δ2肌聚糖單一基因的缺失或突變，使其在生長發育過程中自發形成心肌病。但該模型多數需要從國外引進，操作實用性不佳且成本較高。此外，這種心肌病與某種特定基因突變相關，并不能很好模擬獲得性心肌病的發生。

鈣蛋白酶(Calpain)屬于鈣依賴性的半胱氨酸蛋白酶家族，其中calpain-1是當前家族成員中研究得最為清楚的一種。Calpain-1是異源二聚體，由一個特異的80kDa大催化亞基和共同的28kDa小調節亞基組成的。Calpain-1被鈣離子激活后能通過有限酶切作用裂解底物，進而參與調控多種生理和病理過程。