[發明專利]一種微流體裝置及基于微流體裝置的單細胞核酸適體單輪篩選方法

有效

• 申請號: 201711000204.5
• 申請日: 2017-10-24
• 公開（公告）號: CN109694806B
• 公開（公告）日: 2021-11-19
• 發明（設計）人: 譚蔚泓;蔣健暉;趙子龍
• 申請（專利權）人: 湖南大學
• 主分類號: C12M1/00
• 分類號: C12M1/00;C12N15/10;C12N15/115
• 代理公司: 長沙正奇專利事務所有限責任公司 43113
• 代理人: 馬強;周棟

本發明公開了一種快速獲取核酸適體的微流體裝置，它包括微流體通道，所述微流體通道設有輸入口和輸出口，所述微流體通道內腔底部設有若干個用于分配單個細胞的微室。本發明還公開了基于上述微流體裝置的單細胞核酸適體單輪篩選方法，該方法能高效獲得特異性識別靶細胞的核酸適體。

技術領域

本發明涉及一種微流體裝置及基于微流體裝置的單細胞核酸適體單輪篩選方法。

背景技術

核酸適體是上世紀90年代發展起來的，是通過指數富集配體系統進化技術(SELEX)從含大量寡聚核苷酸的核酸文庫中篩選得到能高親和性高特異性識別靶標的DNA/RNA分子。核酸適體具有可與抗體相媲美的識別功能，目前已成為化學與生物醫學研究的重要工具。傳統的核酸適體篩選技術只能針對純物質(如提純的蛋白質)來進行篩選，難以實現對細胞和復雜生命體系的有效識別。這是因為：1)許多疾病標志物尚未發現；2)可作為標志物的膜蛋白難以純化；3)純化后的蛋白與活細胞生理環境中蛋白的構象存在差異，導致純蛋白為靶標的核酸適體不能識別細胞。我們課題組針對這一難題，提出了針對活細胞這一復雜體系進行核酸適體篩選的新概念，創建了以疾病相關陽性細胞為靶細胞、以陰性細胞為參比的細胞篩選法。細胞篩選方法的發展，解決了如何在標志物未知的情況下獲得研究細胞及其它復雜生命體系所必需的分子探針的關鍵科學問題，為病變細胞膜蛋白標志物的高效發現和鑒定提供了基礎。該方法先后被國際上40多個實驗室采用，得到了同行的普遍認可，已廣泛用于白血病、肺癌、肝癌、胰腺癌、鼻咽癌等多種惡性腫瘤的研究，推動了分子診療學的發展。

細胞篩選法能產生區分正常細胞和疾病細胞之間的分子差異的核酸適體。但是細胞篩選法還存在以下一些缺陷：篩選周期長，通常需要12輪以上的篩選才能獲取結合靶細胞的進化核酸文庫；篩選效率較低，最終產生的進化核酸文庫往往含有大量不能結合靶細胞的核酸序列，阻礙了核酸適體的發現；篩選需要大量細胞，不能針對稀有細胞樣品進行篩選；篩選成本較高。這些缺陷嚴重制約了細胞篩選法在不同實驗室和臨床上的應用。

發明內容

本發明旨在克服現有技術的不足，提供一種微流體裝置及基于微流體裝置的單細胞核酸適體單輪篩選方法。

為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為：

所述微流體裝置包括微流體通道(1)，所述微流體通道(1)設有輸入口(2)和輸出口(3)，所述微流體通道(1)內腔底部設有若干個用于分配單個細胞的微室(4)。

其中，所述微流體通道(1)呈U型折流布置。

所述微流體通道(1)的長、寬、高均為20±0.5微米，優選為20微米；所述微室(4)的直徑為20±0.5微米，優選為20微米；微室(4)的深度為20±0.5微米，優選為20微米；彼此相鄰的微室(4)之間的間距為2200—2400微米，優選為2300微米。

基于上述微流體裝置的單細胞核酸適體單輪篩選方法包括如下步驟：

(1)將靶細胞樣品注射進入微流體裝置，控制流體速度為50-100微升/分鐘，使細胞分散于微流體裝置的微室中；

(2)將設計和合成的核酸適體文庫與參比細胞孵育，然后離心，棄去與參比細胞結合的核酸適體，將未與參比細胞結合的核酸適體注射進入微流體裝置，控制流速為50-100微升/分鐘，使核酸適體與微室中的靶細胞結合；

(3)將洗滌緩沖液注射進入微流體裝置，通過改變洗滌時間和洗滌緩沖液流速來控制篩選壓力，收集洗脫液，將洗脫液中的核酸適體即為篩選后所得的核酸適體；其中，改變洗滌時間的范圍為3-10分鐘，控制洗滌緩沖液的流速為50-100微升/分鐘。

優選地，設計和合成的核酸適體文庫序列如SEQ ID NO.1所示，篩選后所得的核酸適體的序列如SEQ ID NO.2，和SEQ ID NO.3所示。設計和合成的核酸適體文庫序列如SEQID NO.4所示，篩選后所得的核酸適體序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。