[發明專利]一種檢測A549腫瘤細胞電化學傳感器工作電極的制備方法

有效

• 申請號: 201710997151.2
• 申請日: 2017-10-20
• 公開（公告）號: CN107843629B
• 公開（公告）日: 2019-05-21
• 發明（設計）人: 鄭磊;張曄;羅世華;王前;李文源;劉菊梅;司徒博
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學南方醫院
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327;G01N27/48;G01N33/543;G01N33/574
• 代理公司: 廣州市天河廬陽專利事務所(普通合伙) 44244
• 代理人: 胡濟元

本發明涉及一種檢測A549腫瘤細胞電化學感器工作電極的制備方法，該方法由對裸金電極進行拋光處理、滴涂捕獲探針、封閉非特異性位點、滴涂燃料探針、制備Apt?T雙鏈復合物、往Apt?T雙鏈復合物中加入待測細胞液雜交、擴增并固定H1?H2雙鏈復合物和堿性磷酸酶處理8個步驟組成，其中所述的燃料探針的序列如SEQ ID NO.2所示。本發明所述的方法增設了在裸金電極表面滴涂所述燃料探針的步驟，因此可實現雙向催化發夾自組裝反應，顯著提高了檢測的靈敏度。

技術領域

本發明涉及借助于測定材料的化學或物理性質來測試或分析材料，具體涉及通過測試電化學變量測試或分析腫瘤細胞。

背景技術

目前檢測稀有腫瘤細胞的方法主要包括流式細胞術、免疫組化法、熒光原位雜交、微流控檢測技術和二代測序等，這些方法不同程度地解決了腫瘤細胞檢測的相關問題，但目前仍然缺乏一種適用于各實驗室簡便、快速、高靈敏、高特異的檢測方法。流式細胞術具有高通量檢測能力并能對多種腫瘤細胞進行定量和分選，然而昂貴的儀器和對操作及結果分析的人員專業性要求極高，限定了它的普及。近年來備受關注的用于循環腫瘤細胞檢測的平臺，是目前唯一獲得FDA批準用于臨床的循環腫瘤細胞檢測平臺。該平臺利用抗體標記磁珠對細胞進行富集，并將細胞固定后用熒光染料和熒光抗體標記細胞后進行細胞鑒定。該技術能較好的保護細胞形態結構，利于觀察腫瘤細胞形態，為腫瘤細胞檢測提供了新思路，卻仍存在標志物種類局限、假陰性率高和設備精密昂貴等不足。因此，為適應臨床診斷治療，特別是個體化診斷治療的需求，從傳感器著手，發展快速、簡便、高靈敏、高特異的可用于血液、體液中腫瘤細胞檢測的分析方法是當今生物傳感研究領域一項亟待解決的課題，也是近年來研究熱點之一。

電化學傳感器由于選擇性好、響應快、操作簡單樣品需用量少、樣品需用量少、價格低廉等優點而應用到臨床醫學領域，并且在其基礎上建立了各種擴增策略，用于靈敏檢測A549腫瘤細胞，如滾環擴增(RCA)，環介等溫擴增法(LAMP)，催化發夾組裝(CHA)等。滾環擴增(RCA)靈敏度高，特異性較好，但耗時長，操作繁瑣；環介等溫擴增法(LAMP)一步反應，簡便，但引物及長序列模板設計復雜；催化發夾組裝(CHA)作為無酶擴增方法已經被證明在核酸擴增反應中信號放大是穩定和簡單的，由于催化性能和非特異性背景信號，傳統CHA的敏感性不符合臨床樣品中癌細胞檢測的要求，為了進一步提高CHA對癌細胞檢測的分析性能，本工作引入了一種燃料探針，提高了適體傳感器的敏感性。

發明內容

鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明所要解決的技術問題是提供一種檢測A549腫瘤細胞電化學傳感器工作電極的制備方法，該方法所得到的工作電極具有靈敏度高的優點。

本發明解決上述問題的技術方案如下。

一種檢測A549腫瘤細胞電化學感器工作電極的制備方法，該方法由以下步驟組成：

(1)將裸金電極用0.5mm的氧化鋁粉進行拋光處理，置于去離子水中超聲10min，然后取出室溫下晾干；

(2)往經步驟(1)處理的裸金電極表面滴涂預先準備好的濃度為200nM的捕獲探針10μL，4℃下放置12小時；其中所述捕獲探針為，5'-SH-(CH2)6TTTAGTCCAGCGTAATCTACACAACATAAC-3'(SEQ ID NO.1)；

(3)用Tris-HCl緩沖液沖洗經步驟(2)處理的金電極，室溫下晾干后滴加8μL濃度為1mmol mL^-1的6-巰基己醇(MCH)，放置1個小時，再用Tris-HCl緩沖液沖洗，室溫下晾干后滴加10μL濃度為2％的胎牛血清蛋白(BSA)，放置半個小時，以封閉非特異性位點；其中所述Tris-HCl緩沖液的pH為7.4并由Tris、Nacl、MgCl₂和去離子水組成，其中所述Tris、Nacl和MgCl₂的終濃度依次為：20mmolL^-1，100mmolL^-1和5mmolL^-1；