[發明專利]一種檢測A549腫瘤細胞電化學傳感器工作電極的制備方法

有效

• 申請號: 201710997151.2
• 申請日: 2017-10-20
• 公開（公告）號: CN107843629B
• 公開（公告）日: 2019-05-21
• 發明（設計）人: 鄭磊;張曄;羅世華;王前;李文源;劉菊梅;司徒博
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學南方醫院
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327;G01N27/48;G01N33/543;G01N33/574
• 代理公司: 廣州市天河廬陽專利事務所(普通合伙) 44244
• 代理人: 胡濟元

1.一種檢測A549腫瘤細胞電化學感器工作電極的制備方法，該方法由以下步驟組成：

（1）將裸金電極用0.5mm的氧化鋁粉進行拋光處理，置于去離子水中超聲10min，然后取出室溫下晾干；

（2）往經步驟（1）處理的裸金電極表面滴涂預先準備好的濃度為200nM的捕獲探針10μL，4℃下放置12小時；其中所述捕獲探針為， 5'-SH-（CH₂）₆ TTTAGTCCAGCGTAATCTACACAACATAAC -3'；

（3）用Tris-HCl緩沖液沖洗經步驟（2）處理的金電極，室溫下晾干后滴加8μL濃度為1mmol mL^-1的6-巰基己醇，放置1個小時，再用Tris-HCl緩沖液沖洗，室溫下晾干后滴加10μL濃度為2%的胎牛血清蛋白，放置半個小時，以封閉非特異性位點；其中所述Tris-HCl緩沖液的pH為 7.4并由Tris、NaCl、MgCl₂ 和去離子水組成，其中所述Tris、NaCl和MgCl₂的終濃度依次為：20 mmolL^-1，100 mmolL^-1和5 mmolL^-1；

（4）往經步驟（3）處理的金電極表面滴涂預先準備好的濃度為200nM的燃料探針10μL，放置半個小時；其中所述燃料探針為，5'-GTTATGTTGTGTAGAAGGGTT -3'；

（5）將20μL濃度為10μM的識別A549腫瘤細胞的適配體鏈Apt與10μL濃度為10μM的催化鏈T在EP管中混合，室溫反應30min形成Apt-T雙鏈復合物； 其中，所述的適配體鏈序列為ACCCTAACCCTGCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG；所述的催化鏈的序列為，ATCAACTGCAGGGTTAGGGTTAGGGTT；

（6）將所述Apt-T雙鏈復合物中加入待測細胞液，再加入結合緩沖液定容至1 ml，然后置于雜交儀，37℃下中速震動1h，1000 rpm離心15 min；其中所述結合緩沖液的pH為7.5并由Tris、NaCl、MgCl₂ 和去離子水組成，其中所述Tris、NaCl、MgCl₂的終濃度依次為：10mmolL^-1，500 mmolL^-1 和1 mmolL^-1；

（7） 取離心后上清液40 μL與濃度為100nM的發夾 H1和H2各20μL混合，然后滴加到經步驟（4）處理的裸金電極上進行雙重催化發夾自組裝反應擴增，所得擴增產物H1-H2雙鏈復合物被捕獲固定在所述工作電極的表面；其中，

所述的發夾H1的序列為：

AACCCTAACCCTAACCCTCCATGTGTAGAAGGGTTAGGGTT，且其3'端標記有生物素；

所述的發夾H2的序列為：

AACCCTTCTACACATGGAGGGTTAGGGTTCCATGTGTAGATTACGCTGGACT；

（8）取10μL 濃度為0.00125g/ml的親和素化的堿性磷酸酶滴加到經步驟（7）處理的金電極面上，25℃下溫育30 min后用DEA緩沖液清洗，即得所述的工作電極；其中所述DEA緩沖液的pH 為9.6并由NaCl、MgCl₂、二乙醇胺和去離子水組成，其中所述NaCl、MgCl₂、二乙醇胺的終濃度依次為：100 mmolL^-1，1 mmolL^-1，0.1 molL^-1。

2.一種檢測A549腫瘤細胞的方法，該方法包括以下步驟：

將權利要求1所述的工作電極，以及常用的參比電極和對電極放于盛有電解液的燒杯內，然后分別連接測定儀器形成三電極電化學檢測體系，并采用差分脈沖伏安法檢測待測細胞液中A549腫瘤細胞的濃度；所述的電解液為含α-萘基磷酸鹽的DEA緩沖液，其中α-萘基磷酸鹽的終濃度1.0 mg mL^-1。