[發(fā)明專利]用于核酸合成和擴(kuò)增的組合物、方法和試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710996371.3
• 申請(qǐng)日: 2011-06-20
• 公開（公告）號(hào): CN107760770B
• 公開（公告）日: 2022-05-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: C·胡;J·伯克曼;P·嚴(yán)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 生命技術(shù)公司
• 主分類號(hào): C12Q1/686
• 分類號(hào): C12Q1/686
• 代理公司: 中國(guó)貿(mào)促會(huì)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 11038
• 代理人: 李程達(dá)

本發(fā)明涉及用于合成核酸分子的組合物、方法和試劑盒。更具體地，提供了用以在單步驟RT?PCR法中擴(kuò)增核酸分子的組合物、方法和試劑盒，其包括用于增強(qiáng)對(duì)PCR抑制劑的耐受性的一種或多種試劑。

本申請(qǐng)是201180037898.4的分案申請(qǐng)。

相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考:

本申請(qǐng)根據(jù)35U.S.C.§119(e)要求2010年6月21日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/357,021和2011年3月25日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/467,852的優(yōu)先權(quán)的利益，將所述美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)通過引用整體并入本文。

領(lǐng)域:

本公開內(nèi)容涉及用于合成核酸的組合物、方法和試劑盒。更具體地，提供了用于在單步RT-PCR法中擴(kuò)增核酸分子的組合物、方法和試劑盒，其包括一種或多種用于增強(qiáng)對(duì)PCR抑制劑的耐受性的試劑。

背景:

核酸的檢測(cè)、分析、轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增是現(xiàn)代分子生物學(xué)中最重要的方法中的一些方法。此類方法用于核酸分析的應(yīng)用在基因表達(dá)的研究、感染性試劑或遺傳疾病的診斷、cDNA的產(chǎn)生和逆轉(zhuǎn)錄病毒的分析等等應(yīng)用中特別重要。逆轉(zhuǎn)錄RNA，隨后通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行cDNA擴(kuò)增，通常稱為RT-PCR或RNA-PCR，已被廣泛用于檢測(cè)和定量核酸靶并且對(duì)于病毒基因分析特別重要。

致癌病毒及其在癌癥的病理發(fā)生中的作用的研究可在癌癥的診斷和治療中具有重要意義。然而，致癌病毒的檢測(cè)中的可變性可使這些研究成為挑戰(zhàn)性的。檢測(cè)法的靈敏性和特異性是關(guān)鍵問題。早期檢測(cè)可通過使用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)還未經(jīng)歷血清轉(zhuǎn)換的樣品中的致癌病毒核酸來實(shí)現(xiàn)，此類技術(shù)適用于不能在組織培養(yǎng)中繁殖的病毒。常規(guī)地，免疫檢測(cè)法已被用于檢測(cè)致癌病毒的存在，但此類方法具有幾個(gè)缺點(diǎn)。在人乳頭瘤病毒(HPV)(其可引起宮頸癌)的情況下，檢測(cè)因早期病毒蛋白質(zhì)的低表達(dá)和可區(qū)分HPV類型的的靈敏且特異的高質(zhì)量抗體的缺乏而十分困難(Villa and Denny,International Journal ofGynecology and Obstetrics,94(Suppl.1):S71-S80(2006))。當(dāng)樣品因可以在樣品收集之前已發(fā)生數(shù)目或數(shù)年的感染(如在愛潑斯坦-巴爾病毒(EBV)的情況下)而顯示殘余的抗體水平時(shí)，結(jié)果還可引起誤導(dǎo)或不能得出結(jié)論，所述愛潑斯坦-巴爾病毒與何杰金淋巴瘤及其它癌相關(guān)(國(guó)家傳染病中心(National Center for Infectious Diseases)。“愛潑斯坦-巴爾病毒和傳染性單核細(xì)胞增多癥”，CDC.http://www.cdc.gov/ncidod/diseases/ebv.htm(2010年11月))。病毒核酸的基于PCR的檢測(cè)不僅因序列特異性引物結(jié)合而具有高度特異性的有利方面，而且其還因?yàn)槠鋽U(kuò)增更短的核酸片段的能力而比其它雜交技術(shù)例如Northern和Southern印跡那樣麻煩比它們更靈敏。序列特異性探針結(jié)合給實(shí)時(shí)PCR添加了額外層的特異性并且具有提供病毒載量信息的額外有利方面。

RT-PCR通常包括兩個(gè)單獨(dú)的分子合成：(i)cDNA從RNA模板的合成；和(ii)新合成的cDNA通過PCR擴(kuò)增的復(fù)制?？墒褂脙煞N或更多種酶，通過單步(或偶聯(lián))RT-PCR法進(jìn)行RT-PCR，其中將至少兩種單獨(dú)的酶(例如，逆轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶)分別用于初始cDNA合成和隨后的擴(kuò)增。

在單步RT-PCR中，將逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增組合至單個(gè)反應(yīng)混合物中，這提供了優(yōu)于兩步驟RT-PCR(其中使用兩個(gè)不同的或單獨(dú)的反應(yīng)進(jìn)行合成和擴(kuò)增步驟)的眾多有利方面。單步驟RT-PCR需要比二步驟RT-PCR更少的對(duì)于反應(yīng)混合物和核酸產(chǎn)物的操作(例如，兩個(gè)反應(yīng)步驟之間為了添加組分或酶而進(jìn)行的反應(yīng)管的打開)，從而是勞動(dòng)密集度較低并且耗時(shí)較少的方法。必要時(shí)，單步驟RT-PCR還允許使用更少的樣品，以及減小污染的風(fēng)險(xiǎn)(Sellner和Turbett,Biotechniques25:234-238(1998))。