[發(fā)明專利]一種具有抗幽門螺旋桿菌活性的抗菌肽的制備方法

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• 申請日: 2017-10-23
• 公開（公告）號: CN107641150A
• 公開（公告）日: 2018-01-30
• 發(fā)明（設計）人: 張孝林;汪建飛;蔣安民;貢成良;范濤;張欽元
• 申請（專利權）人: 安徽科技學院
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;C07K19/00;C12N15/62;C12N15/866;C12N5/10;A61K38/16;A61P31/04
• 代理公司: 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙)11371
• 代理人: 蔡蓉

技術領域

本發(fā)明涉及制藥領域，具體而言，涉及一種具有抗幽門螺旋桿菌活性的抗菌肽的制備方法。

背景技術

幽門螺旋桿菌是上世紀80年代由澳大利亞兩位科學家發(fā)現(xiàn)并于2005年獲得諾貝爾生理學獎。目前，世界上有50％以上的人口感染有這種病原菌，其中20％的感染者將會引起慢性胃炎、消化性和十二指腸潰瘍、胃癌和粘膜相關淋巴組織瘤的臨床癥狀。世界衛(wèi)生組織已把它列為Ⅰ類致癌原。在發(fā)展中國家更加廣泛流行，我國有些地區(qū)人口感染率高達60％以上。

抗生素是治療幽門螺旋桿菌感染的有效方法，但幽門螺旋桿菌對多種抗生素產生耐藥性，甚至同一感染病人對7種抗生素抵抗。目前，對有這種明顯疾病癥狀個體治療方法主要是用一種質子泵結合二種或三種抗生素的聯(lián)合療法，其有80％的根除率和隨后的臨床癥狀的改善，已經成為標準的治療方法。但是，隨著抗生素耐藥菌株的增加、重新感染、并發(fā)癥和高治療費用及治療依從性差等因素限制了抗生素對幽門螺旋桿菌感染的根治，其中最主要的原因就是細菌的耐藥性。鑒于此，目前急需對幽門螺旋桿菌感染疾病，提出一種不依賴于抗生素的治療方案。

發(fā)明內容

本發(fā)明的第一目的在于提供一種具有抗幽門螺旋桿菌活性的抗菌肽以及包含該抗菌肽的融合蛋白。這種抗菌肽具有抗幽門螺旋桿菌活性，且在胃環(huán)境中具有較強的穩(wěn)定性和抗菌活性，其通過物理作用造成細胞膜的穿孔而達到抗幽門螺旋桿菌的效果，在使用過程中不容易使幽門螺旋桿菌產生耐藥性。

本發(fā)明的第二目的在于提供一種上述抗菌肽以及融合蛋白在制備治療幽門螺旋桿菌病的藥物中應用，由于該抗菌肽在胃環(huán)境中不會被胃蛋白酶破壞，且在胃酸環(huán)境下依然能保持較強的抗菌活性，可作為活性成分用于制備治療幽門螺旋桿菌病的藥物。

本發(fā)明的第三目的在于提供一種用于編碼上述抗菌肽的基因、以及用于編碼上述融合蛋白的基因。

本發(fā)明的第四目的在于提供一種編碼抗菌肽的基因以及編碼融合蛋白的基因在制備治療幽門螺旋桿菌病的藥物中的應用。

本發(fā)明的第五目的在于提供一種具有抗幽門螺旋桿菌活性的抗菌肽的制備方法，該方法采用基因工程方法表達包含有抗菌肽的融合蛋白，從而降低抗菌肽的等電點，使其達到高水平的表達，降低生產成本。

本發(fā)明的第六目的在于提供一種具有抗幽門螺旋桿菌活性的蠶血淋巴及其制備方法和用途。這種蠶血淋巴中同時含有融合蛋白和腸激酶，該融合蛋白經腸激酶的特異性酶切后，獲得具有天然結構的抗菌肽，因此，該蠶血淋巴具有了抗幽門螺旋桿菌的活性、且該蠶血淋巴可以直接口服或冷凍干燥就可用于治療幽門螺旋桿菌感染，極大的降低抗菌肽的生產成本。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術方案：

第一方面，本發(fā)明提供一種具有抗幽門螺旋桿菌活性的抗菌肽、融合蛋白，具體為：

一種具有抗幽門螺旋桿菌活性的抗菌肽，抗菌肽的氨基酸序列為(1)或(2)：

(1)SEQ ID NO:1所示的序列；

(2)由SEQ ID NO:1所示的序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的且與SEQ ID NO:1具有相同的生物活性的衍生序列。

一種具有抗幽門螺旋桿菌活性的抗菌肽，抗菌肽的氨基酸序列為(1)或(2)：

(1)SEQ ID NO:1所示的序列；

(2)由SEQ ID NO:1所示的序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的且與SEQ ID NO:1具有相同的生物活性的衍生序列。

一種包含有上述抗菌肽的融合蛋白，融合蛋白具有以下一級氨基酸序列結構：

載體蛋白-連接肽-蛋白酶作用位點肽段-抗菌肽；

抗菌肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

進一步地，上述載體蛋白包括家蠶桿狀病毒核多角體蛋白、谷胱甘肽巰基轉移酶、綠色熒光蛋白、或泛素樣小蛋白。

進一步地，上述家蠶桿狀病毒核多角體蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO:2。

進一步地，上述連接肽包括(GGGGS)_n,其中n＝1～4。

進一步地，上述蛋白酶作用位點肽段為特異性蛋白內切酶的作用位點，特異性蛋白內切酶包括腸激酶、凝血酶、凝血因子Xa、PreScission蛋白酶、煙草花葉病毒蛋白酶、人鼻病毒蛋白酶、泛素樣小蛋白酶。

進一步地，上述蛋白酶作用位點肽段包括LVPRGS、IEGR、IDGR、LEVLFQ、ENLYFQG、LEVLFQG或泛素樣蛋白三級結構。