[發明專利]一種細菌鑒別的方法

有效

• 申請號: 201710992820.7
• 申請日: 2017-10-23
• 公開（公告）號: CN109696431B
• 公開（公告）日: 2022-02-08
• 發明（設計）人: 勾洪磊;葛亮皓;王乙潛;徐健
• 申請（專利權）人: 中國科學院青島生物能源與過程研究所
• 主分類號: G01N21/65
• 分類號: G01N21/65;C12Q1/04
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 崔佳佳;馬莉華

本發明提供了一種細菌鑒別或耐藥細菌鑒別的方法，采用基于貴金屬納米顆粒活性基底的表面增強拉曼散射技術，結合細菌對外源壓力的應激反應機制，對其特異性的應激分泌物進行拉曼檢測，實現了對細菌類別或是否具有耐藥性進行快速區分和判斷。

技術領域

本發明構建了一種基于細菌分泌物和表面增強拉曼散射(SERS)技術的細菌鑒別或耐藥菌快速檢測方法，為生物、醫療、衛生等領域中的細菌鑒別和耐藥菌快速檢測提供一種方法，本發明屬于生物技術和快速檢測領域。

背景技術

抗生素的發明，挽救了無數生命，然而隨著長期的抗生素過度使用，細菌耐藥性已成為一個全球性的嚴重問題。耐藥菌的出現，對人類健康和疾病診治能力造成了嚴重威脅。為了對抗耐藥性細菌，迫切需要研發新的更為有效的抗生素投入臨床使用，然而由于藥物研發的漫長周期和巨大成本，當前最為迫切和現實的是減少抗生素的不合理使用，從而控制細菌耐藥性的發展和傳播。這就需要更為快速和靈敏的病原菌及其耐藥性的臨床診斷方法和工具，及時指導治療用藥從而提高抗生素使用的針對性和有效性。

在臨床上，分離培養方法仍是明確病原菌和進行藥敏試驗的金標準。臨床病體樣本需進行處理分離并接種培養，增殖至可檢測水平后經生化檢驗或質譜分析確定病原菌類型；再通過梯度稀釋或紙片擴散等傳統藥敏試驗方法判斷其耐藥屬性和程度。這些方法耗時較長，通常最好的情況下可在24小時內確定致病菌，在48小時內反饋藥敏試驗結果，在此期間醫生只能對病情做經驗性判斷，影響治療效果。在對細菌進行鑒定上，生化檢驗方法技術可靠、成本低，然而操作繁瑣，容量及準確性有限；而質譜技術快速準確，但儀器昂貴、通量有限。而常規藥敏試驗方法，如紙片法等，操作簡便，結果直觀，但培養過程及其耗時。近年來隨著分子生物學技術和其他技術的發展涌現出一些新型檢測手段，其中包括PCR技術、宏基因組測序等。PCR技術通過對特定目的基因片段的擴增可以鑒別細菌種類及耐藥基因，操作簡單、結果準確；宏基因組測序能夠提供檢測樣品的完整序列，通過數據庫分析可發現大量的信息，但成本高，分析周期長，在做大范圍環境中耐藥菌及耐藥基因普查中極有優勢。上述分子生物學技術無需對細菌進行培養，方便快捷，但檢測成本較高，且無法給出具體的藥敏性結果。綜上所述，目前的常規檢測方法尚無法實現對病原菌及其耐藥性進行快速準確檢測的臨床目標。因此，設計一種能夠快速鑒別細菌種類以及快速檢測耐藥性細菌的方法具有十分重要的應用價值，對于臨床診療及抑制抗生素耐藥性具有重大意義。

發明內容

針對以上技術問題，本發明提供了一種細菌鑒別的方法，采用基于貴金屬納米顆粒活性基底的表面增強拉曼散射技術，結合細菌對外源壓力的應激反應機制，對其特異性的應激分泌物進行拉曼檢測，實現了對細菌類別區分和判斷。

本發明提供一種細菌鑒別的方法，包括：

1)對所述測試細菌樣品施加外源壓力，誘發所述待測細菌樣品的應激反應機制，使待測細菌樣品產生分泌物，所述施加外源壓力選自施加熱激、輻射、高壓強、低滲透壓、化學固定物質、殺菌劑、和/或抗生素；

2)加入貴金屬納米顆粒吸附所述分泌物，充分混合后加入誘導團聚試劑，使貴金屬納米顆粒相互團聚形成拉曼增強“熱點”，利用表面增強拉曼光譜技術進行檢測獲得拉曼光譜測定結果；

3)將步驟2)獲得的拉曼光譜測定結果與已知細菌分泌物測定的拉曼光譜或者預測的光譜標志進行比對來鑒別所述待測細菌樣品。

所述施加外源壓力的時間為1-60分鐘，優選地為10-30分鐘。

本發明提供了一種耐藥細菌鑒別的方法，包括：

1)在待測細菌樣品中加入特定藥物作用于細胞，使待測細菌樣品產生分泌物；

2)加入貴金屬納米顆粒吸附所述分泌物，充分混合后加入誘導團聚試劑，使貴金屬納米顆粒相互團聚形成拉曼增強“熱點”，利用表面增強拉曼光譜技術進行檢測獲得拉曼光譜測定結果；