[發(fā)明專利]血小板裂解液(HPL)替代胎牛血清(FBS)培養(yǎng)用于人體的骨髓間質(zhì)干細胞的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201710991038.3
• 申請日: 2017-10-16
• 公開（公告）號: CN109666635A
• 公開（公告）日: 2019-04-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李輝
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明涉及用HPL替代FBS培養(yǎng)MSCs能夠避免動物源性物質(zhì)對MSCs的臨床應(yīng)用產(chǎn)生的負面影響，對MSCs的體外培養(yǎng)擴增及臨床應(yīng)用起到相應(yīng)的指導(dǎo)作用。本發(fā)明HPL能夠促進MSCs的成骨/成脂分化能力，由此看來，HPL培養(yǎng)的MSCs可能在骨組織工程領(lǐng)域得到更好的應(yīng)用；在成骨不全等骨組織缺陷或損傷疾病的治療和修復(fù)中可能取得更好的療效，為這些疾病的細胞治療提供更高效的細胞制劑。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及間質(zhì)干細胞及轉(zhuǎn)化。

背景技術(shù)

間質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是來源于中胚層的一類具有自我更新和多向分化潛能的干細胞，可以從多個物種的多種組織中分離出MSCs，如骨髓、脂肪組織、外周血等。MSCs具有多向分化潛能，可分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、心肌細胞等[1]。目前，MSCs被廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域以及某些疾病的臨床試驗性治療當(dāng)中，Horwitz EM[2]等對患有成骨不全的6名兒童在接受常規(guī)的骨髓移植后進行同種異基因MSCs輸注，經(jīng)MSCs輸注后5名患兒的生長速度顯著加快，根據(jù)對這5例成骨不全患兒MSCs輸注的療效觀察，作者認為MSCs可以用于成骨不全患兒骨髓移植后的細胞治療，并進一步提出MSCs可能對其他遺傳性或獲得性疾病具有一定的療效。此外，Quarto R等及SimonTilley等運用組織工程方法利用MSCs治療骨組織缺損，取得確切療效[3，4]。

臨床應(yīng)用時通常需要大量的MSCs，目前認為適宜的臨床輸注劑量為成人每公斤體重輸注2×106個MSCs[19]，因此MSCs被用于臨床治療時必須經(jīng)過體外培養(yǎng)擴增才能達到足夠的細胞量。MSCs易于體外分離和擴增，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)被廣泛的用于MSCs的培養(yǎng)當(dāng)中，有可能導(dǎo)致朊病毒或者某些未確診的動物傳染病的傳播，此外，在培養(yǎng)過程中動物源的蛋白或肽可能會被整合至MSCs中從而導(dǎo)致免疫排斥。Spees JL[5]等發(fā)現(xiàn)大鼠在反復(fù)輸注用FBS培養(yǎng)的MSCs后產(chǎn)生了明顯的體液免疫反應(yīng)；Horwitz EM[2]等在利用MSCs治療兒童成骨不全的試驗中同樣產(chǎn)生了免疫反應(yīng)，有一名患兒在兩次輸注MSCs后出現(xiàn)蕁麻疹，并且MSCs的輸注對這名患兒無明顯療效。因此，一些研究嘗試用其他物質(zhì)代替FBS來培養(yǎng)MSCs，Bieback K[6]等用人血清、血漿代替FBS培養(yǎng)MSCs，但沒有獲得很好的效果，血清或血漿培養(yǎng)MSCs時會混雜大量的造血細胞，而且MSCs在培養(yǎng)至第四代時增殖速度明顯降低，很難達到臨床應(yīng)用所需要的細胞量；然而用人血小板裂解液(human platelet lysate，HPL)培養(yǎng)時卻不存在上述缺點。HPL是裂解血小板后得到的富含生長因子的血漿，其中含有由血小板分泌的主要的生長因子，如血小板源生長因子(PDGF)、堿性成纖維細胞生長因子(b-FGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)、胰島素樣生長因子(IGF-I)等，HPL的培養(yǎng)能夠比FBS更高效的促進MSCs體外擴增，同時保持其多向分化潛能以及免疫調(diào)節(jié)功能，HPL可以作為FBS合適而安全的替代品。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于，提供一種血小板裂解液(HPL)替代胎牛血清(FBS)培養(yǎng)用于人體的骨髓間質(zhì)干細胞的方法。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題，采用的技術(shù)方案是，提供一種血小板裂解液(HPL)替代胎牛血清(FBS)培養(yǎng)用于人體的骨髓間質(zhì)干細胞的方法，其特征在于，收集10袋機采血小板(每個供者0.2個單位)在-80℃凍存，接著快速在37℃溶解。900r/min離心30min。取上清，0.22μm過濾器過濾，加肝素2U/ml以防止血小板凝膠的形成。血小板裂解液采用ELISA方法進行PDGF-AB(人血小板衍生生長因子AB)，bFGF(成纖維細胞生長因子)，IGF-1(胰島素樣生長因子1)，TGF-β1(轉(zhuǎn)化生長因子β1)4種細胞因子濃度的檢測

優(yōu)選的，7.5％HPL和10％FCS培養(yǎng)MSCs原代過程中，均在接種5d左右出現(xiàn)貼壁細胞，呈長梭形，克隆樣增殖，10～15d達到融合，消化傳代。