[發明專利]血小板裂解液(HPL)替代胎牛血清(FBS)培養用于人體的骨髓間質干細胞的方法

在審

• 申請號: 201710991038.3
• 申請日: 2017-10-16
• 公開（公告）號: CN109666635A
• 公開（公告）日: 2019-04-23
• 發明（設計）人: 李輝
• 申請（專利權）人: 廣東食品藥品職業學院
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種血小板裂解液(HPL)替代胎牛血清(FBS)培養用于人體的骨髓間質干細胞的方法，其特征在于，收集10袋機采血小板(每個供者0.2個單位)在-80℃凍存，接著快速在37℃溶解。900r/min離心30min。取上清，0.22μm過濾器過濾，加肝素2U/ml以防止血小板凝膠的形成。血小板裂解液采用ELISA方法進行PDGF-AB(人血小板衍生生長因子AB)，bFGF(成纖維細胞生長因子)，IGF-1(胰島素樣生長因子1)，TGF-β1(轉化生長因子β1)4種細胞因子濃度的檢測。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，7.5％HPL和10％FCS培養MSCs原代過程中，均在接種5d左右出現貼壁細胞，呈長梭形，克隆樣增殖，10～15d達到融合，消化傳代。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，MSCs培養至第5代，進行消化，檢測表面標記CD45，CD34，CD29，CD44，CD105，CD106。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，10％的FCS培養的MSCs其細胞周期為S期：(1.42±1.83)％，G0-G1期：(96.97±0.95)％，G2-M期：(1.61±1.56)％；7.5％的HPL培養的MSCs其細胞周期為S期(3.54±2.55)％，G0-G1期：(94.58±1.56)％，G2-M期：(1.88±1.64)％；從上述數據可以看出G0～G1期細胞所占比例在90％以上，這說明絕大部分細胞處于靜止態，保留自我更新和增殖能力，這符合干細胞的特性。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，對培養至第5代的HPL和FCS培養條件下MSCs分別進行成骨誘導，誘導10-12天左右光鏡下可見致密團塊樣的結節形成，結節大小不等，對其進行茜素紅染色，結節被染為紅色，證實為鈣結節。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，同樣對培養至第5代HPL和FCS培養條件下的兩組MSCs進行成脂誘導，在誘導8天時大多數細胞內脂滴已經明顯可見，隨著誘導時間的延長，小脂滴逐漸聚集成大的脂泡，誘導12天后運用油紅0染色可見細胞內脂滴被染成紅色。