[發明專利]一種使用基因組DNA測定端粒長度的熒光定量原位雜交(Q-FISH)方法

有效

• 申請號: 201710990329.0
• 申請日: 2017-10-23
• 公開（公告）號: CN108004299B
• 公開（公告）日: 2021-07-06
• 發明（設計）人: 孫冰
• 申請（專利權）人: 濟南海灣生物工程有限公司
• 主分類號: C12Q1/6841
• 分類號: C12Q1/6841;C12N15/11
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 李桂存

本發明提供了一種使用基因組DNA測定端粒長度的熒光定量原位雜交(Q?FISH)方法：將基因組DNA固定于玻片后與端粒?特異性PNA探針雜交，再采集熒光數據；該方法同時適用于分裂活躍及衰老細胞的端粒長度測定；可獲得多個端粒長度參數：平均端粒長度，端粒長度變異，長度異常端粒的頻率，消除了單一依賴平均端粒長度評價端粒功能獲得信息的缺陷。本發明還提供了一種特異性更強的端粒?特異性PNA探針，將TTAGGG縮短到2個重復，使探針用量減半而熒光信號加倍。本發明同時提供了一種端粒長度標準品及其制備方法，可用于測量每個端粒的堿基長度，還可作為不同試驗間的校正標準。若本發明采用自動化的檢測方法，可大量樣品的處理，較其他方法節省人力。

技術領域

本發明涉及一種使用基因組DNA來測量個體端粒的長度的方法及端粒長度的標準品及其制備方法，具體涉及一種使用基因組DNA測定端粒長度的熒光定量原位雜交(Q-FISH)方法，屬于分子生物學檢測領域。

背景技術

端粒是位于真核細胞線性染色體末端的一小段DNA-蛋白質復合體，其作用是保護染色體DNA的末端，避免染色體DNA的降解、末端融合以及非正常重組等。在哺乳動物細胞中，端粒DNA由TTAGGG序列重復串聯組成。由于DNA的末端復制問題，細胞的每次分裂都伴隨著端粒DNA一小段序列的丟失。細胞的每次分裂都會伴隨著染色體末端端粒的縮短，細胞也因此逐漸老化、直至喪失復制能力而死亡。一部分喪失關鍵細胞周期檢測點功能的細胞可能會躍過細胞復制性衰老繼續分裂最終進入危機期。這個時期的極少數細胞獲得了端粒酶活性，并且繼續分裂轉化為腫瘤細胞。

端粒長度的變化與多種疾病密切相關，如癌癥、早衰綜合征等。端?？s短不僅與老化有關，而且與幾種與年齡相關的疾病有關，如腫瘤，糖尿病，神經變性疾病，心血管疾病，特別是心力衰竭。端粒長度可作為生物或細胞衰老的生物標志物，作為染色體穩定性，端粒酶活性，增殖能力和衰老過程的有用指標。因此，測量端粒長度能提供與疾病相關的重要信息。最常用的端粒長度檢測方法包括：端粒末端限制性片段分析（terminal restrictionfragment，TRF），定量PCR（qPCR），單鏈端粒長度分析（single telomere length analysis，STELA），熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）和流式熒光原位雜交（flow cytometry and flow fluorescence in situ hybridization，Flow FISH）。

端粒末端限制性片段分析是最早最經典的端粒長度檢測的方法。此方法是根據端粒序列特異且重復的特性，用一組缺乏端粒識別位點的頻繁切割限制性內切酶消化基因組DNA，基因組DNA被消化成短片段，端粒DNA則不被切割以較長的片段保留。不同長度的DNA消化產物在瓊脂糖凝膠上分離，用端粒DNA特異的探針通過Southern blotting方法檢測端粒長度。提取的基因組DNA的完整性對TRF法定量端粒長度十分重要，DNA降解會導致對端粒長度評估的不準確。TRF的局限在于測量的是群體細胞的平均端粒長度（平均TL），且需要的DNA量多。此外，這種方法檢測的端粒長度包含了亞端粒DNA。

為了克服分析端粒長度需要DNA量多的局限，以qPCR為基礎的端粒長度檢測方法得以研發。用與端粒C鏈和G鏈都能退火但與其他堿基不匹配的引物通過PCR擴增端粒，前兩個循環用低溫退火使引物與端粒DNA模板配對產生端粒產物，其余循環用高溫退火確保僅擴增前兩個循環得到的端粒產物（抑制引物和端粒DNA模板退火和引物二聚體產生）。端粒擴增產物（T）的量與擴增的單拷貝基因的量（S）進行比值來對端粒長度定量。qPCR的局限是需要擴增對照基因，而擴增的對照基因在基因組中是獨特的，其拷貝數的變異和染色體的復制會改變基因拷貝數，從而顯著改變T/S值。因此，qPCR法只適合用于二倍體和核型穩定的細胞和樣本，轉化細胞系和腫瘤組織樣本是不適合的。此外，qPCR法也只能評估平均端粒長度，而且樣本內和樣本間的差異還是比較高的，不同實驗室得出的結果相差很大。