[發明專利]一種使用基因組DNA測定端粒長度的熒光定量原位雜交(Q-FISH)方法

有效

• 申請號: 201710990329.0
• 申請日: 2017-10-23
• 公開（公告）號: CN108004299B
• 公開（公告）日: 2021-07-06
• 發明（設計）人: 孫冰
• 申請（專利權）人: 濟南海灣生物工程有限公司
• 主分類號: C12Q1/6841
• 分類號: C12Q1/6841;C12N15/11
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 李桂存

1.一種用于端粒長度測定的端粒-特異性PNA探針，其特征在于，端粒-特異性PNA探針為N端帶有熒光基團的miniPEG-γ PNA，端粒-特異性PNA探針堿基序列如SEQ ID NO:1所示；其第3位堿基與第7位堿基的γ位修飾miniPEG。

2.根據權利要求1所述的端粒-特異性PNA探針，其特征在于，熒光基團選自Cy3或Alexa488。

3.根據權利要求1所述的端粒-特異性PNA探針，其特征在于，熒光基團與N端堿基間添加1-2個O-linker。

4.一種端粒長度標準品的制備方法，其特征在于，通過以下步驟獲得：

a）合成包含XhoI和SalI酶切位點的TTAGGG重復片段；

b）以端粒重復片段為模板進行PCR，得PCR產物；

c）將序列正確的步驟b）獲得的PCR產物最終克隆入質粒載體，獲得重組質粒；

d）將步驟c）的重組質粒XhoI酶切為開鏈；

e）以步驟c）的重組質粒為模板進行PCR，得PCR產物SalI酶切后獲得端粒插入片段；

f）將步驟d）的開鏈與步驟e）的端粒插入片段以Chew-back方式連接，獲得新的閉環質粒；

g）以步驟f）獲得的新的閉環質粒為對象重復步驟d）-f）一到多次；

h）將步驟g）獲得的閉環質粒在非端粒片段區域酶切為開鏈或釋放出端粒片段，即為端粒長度標準品；

所述端粒重復片段，包含多個端粒重復序列；其緊鄰端粒重復序列的5’端與3’端分別連接有XhoI 和SalI限制性內切酶位點。

5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，包含多段端粒重復序列TTAGGG；所述多段端粒重復序列總長度為100bp-4kb。

6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述多段端粒重復序列總長度為100，200，400，600，900 bp以及1.2，2.4和3.6 kb。

7.一種非診斷目的的使用基因組DNA測定每個端粒長度的熒光定量原位雜交方法，其特征在于，采用以下步驟：

（1）提取基因組DNA；

（2）將步驟（1）中的基因組DNA涂覆并固定于載玻片上，與端粒-特異性PNA探針完成雜交；將不同長度的端粒長度標準品涂覆并固定于載玻片上，與端粒-特異性PNA探針完成雜交；

（3）采集不同長度的端粒長度標準品的熒光信號和圖像并測量熒光強度，獲得熒光強度-堿基長度標準曲線及方程，進而計算端粒長度參數；

步驟（2）中具體的步驟為：

a）將基因組DNA或不同長度的端粒長度標準品分別溶于結合緩沖液，再涂覆于載玻片上；

b）上述步驟a）獲得的載玻片于75℃下加熱1小時，然后在0-4℃冷甲醇中固定，然后烘干玻片，得覆載DNA的載玻片；

c）端粒-特異性PNA探針溶于雜交緩沖液，涂覆于上述覆載DNA的載玻片完成雜交并漂洗；

所述結合緩沖液配制方法如下：10 g NaI以6.6 mL0.5% NaH₂PO₂溶解；

所述端粒-特異性PNA探針為權利要求1-3任一所述的端粒-特異性PNA探針；

所述端粒長度標準品為權利要求4-6任一所述的制備方法獲得的端粒長度標準品。

8.根據權利要求7所述的熒光定量原位雜交方法，其特征在于，雜交使用的基因組DNA的量為0.1 ng-200 ng。

9.根據權利要求7所述的熒光定量原位雜交方法，其特征在于，每片載玻片上可涂覆容納1到多個樣品。

10.根據權利要求7所述的熒光定量原位雜交方法，其特征在于，每片載玻片上可涂覆容納樣品數為16-24個。

11.根據權利要求7所述的熒光定量原位雜交方法，其特征在于，步驟（3）中每個樣品隨機分析2000個以上端粒。