[發(fā)明專利]一種膠基型煙草制品對唾液總細(xì)菌影響的檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710988313.6
• 申請日: 2017-10-21
• 公開（公告）號: CN107699611A
• 公開（公告）日: 2018-02-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高茜;李雪梅;陸舍銘;米其利;朱洲海;管瑩;徐玉瓊;夭建華
• 申請（專利權(quán)）人: 云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/06
• 代理公司: 昆明正原專利商標(biāo)代理有限公司53100
• 代理人: 金耀生,于洪

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種膠基型煙草制品對唾液總細(xì)菌影響的檢測方法。

背景技術(shù)

Nasidze等通過對全球12個(gè)國家和地區(qū)的120例健康人群唾液樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)204個(gè)細(xì)菌基因?qū)伲渲?9個(gè)是以前從沒有被描述過的口腔菌屬，6 4個(gè)為未知種屬。該研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，口腔細(xì)菌組具有個(gè)體特異性，但多樣性幾乎不受地理結(jié)構(gòu)的影響。另有研究采集了特定牙位的齦上菌斑和齦下菌斑以及唾液等26種樣本并將其混合，鑒定出9個(gè)門的247種細(xì)菌，這些細(xì)菌在種和株水平上存在明顯的個(gè)體差異，與腸道細(xì)菌在屬的水平上存在顯著的差異。有研究者將核心微生物按豐度高低依次排列為：鏈球菌屬(25％)、普雷沃菌屬(16％)、嗜血桿菌屬(12％)、羅思菌屬(7％)、韋榮球菌屬(6％)、奈瑟菌屬(6％)、梭桿菌屬(6％)和卟啉菌屬(4％)。

研究者認(rèn)為當(dāng)口腔內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，原有的口腔微生態(tài)平衡受到破壞形成新的生態(tài)環(huán)境或滯留區(qū)，對口腔內(nèi)定居微生物會產(chǎn)生影響，口腔微生物的種類、數(shù)量、微生物與微生物之間、微生物與宿主之間的相互關(guān)系均發(fā)生變化，這些變化都可能會導(dǎo)致基牙產(chǎn)生齲病和牙周病變。因此口腔相關(guān)微生物的變化是口腔微環(huán)境的重要指標(biāo)之一。

膠基型無煙氣煙草制品(Tobacco chewing gum)是一種在膠基中加入了一定量的煙草提取物、香料以及其他一些食用添加劑制成的一種口用無煙氣煙草制品。膠基型煙草制品的使用方式是放入口中咀嚼，咀嚼的溶出物會與唾液匯合聚集在口腔中，根據(jù)消費(fèi)習(xí)慣的不同吐出或者咽下。在產(chǎn)品使用的過程中，產(chǎn)品對人口腔健康的影響是一個(gè)重要考察指標(biāo)。目前的煙草制品僅針對產(chǎn)品本身進(jìn)行一些物理化學(xué)指標(biāo)的檢測，而對人口腔中的微生物影響研究較少，尤其是針對口腔中唾液總細(xì)菌的研究未曾涉及。因此如何克服現(xiàn)有技術(shù)的不足是目前生物檢測技術(shù)領(lǐng)域亟需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種膠基型煙草制品對唾液總細(xì)菌影響的檢測方法，該方法首先采集志愿者的唾液，并針對膠基型產(chǎn)品的使用特點(diǎn)，采用全仿真模擬咀嚼機(jī)來模擬膠基型煙草制品的咀嚼過程，對咀嚼過程中唾液中總細(xì)菌含量進(jìn)行熒光定量PCR分析，從而考察在使用膠基型煙草制品前后唾液中的總細(xì)菌含量的變化，為膠基型煙草制品的口腔健康提供參考。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種膠基型煙草制品對唾液總細(xì)菌影響的檢測方法，包括如下步驟：

步驟(1)，采集健康志愿者唾液，編號為1#液體；

步驟(2)，將膠基型煙草制品放入模擬咀嚼機(jī)中，并分多次注入步驟(1) 采集到的唾液，進(jìn)行人工咀嚼，咀嚼過程中，收集不同咀嚼時(shí)間點(diǎn)的唾液；

步驟(3)，將步驟(2)收集到的不同咀嚼時(shí)間點(diǎn)的唾液與采集到的唾液一起放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱于37℃下進(jìn)行共培養(yǎng)；之后分別提取各時(shí)間點(diǎn)的培養(yǎng)液中唾液總細(xì)菌DNA，同時(shí)提取多種口腔細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株混合物的原始DNA；

步驟(4)，以濃度梯度稀釋10倍的多種口腔細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株混合物的原始D NA作為模板進(jìn)行熒光定量PCR分析，之后繪制熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線；

同時(shí)，分別以各時(shí)間點(diǎn)的培養(yǎng)液中唾液總細(xì)菌DNA作為模版進(jìn)行熒光定量 PCR分析，空白對照模板采用滅菌雙蒸水，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)液中唾液總細(xì)菌含量；

其中，熒光定量PCR反應(yīng)所使用的上游引物為5’-cgctagtaatcgtggatcaga atg-3’；下游引物為5’-tgtgacgggcggtgtgta-3’；探針為FAM-cacggtgaatacgttccc gggc-TAMRA。

進(jìn)一步，優(yōu)選的是，步驟(2)的具體方法為：

將0.8-1.2g膠基型煙草制品放入全仿真模擬咀嚼機(jī)的溶液皿中，注入步驟 (1)采集到的唾液5mL，進(jìn)行人工咀嚼；設(shè)置咀嚼機(jī)械齒以5秒一次的頻率進(jìn)行上下咬合且左右磨錯(cuò)動(dòng)作，共20次，咬合寬度為15mm；同時(shí)，啟動(dòng)左右開合旋轉(zhuǎn)組件，每隔4次上下咬合且左右磨錯(cuò)動(dòng)作做一次聚攏翻滾動(dòng)作，每次聚攏翻滾夾板的旋轉(zhuǎn)角度為45°；完成后收集溶液皿中的液體，編號為2#液體；

第二次再注入步驟(1)采集到的唾液5mL，進(jìn)行人工咀嚼；設(shè)置咀嚼機(jī)械齒以10秒一次的頻率進(jìn)行上下咬合且左右磨錯(cuò)動(dòng)作，共10次，咬合寬度為10 mm；同時(shí)，啟動(dòng)左右開合旋轉(zhuǎn)組件，每隔5次上下咬合且左右磨錯(cuò)動(dòng)作做一次聚攏翻滾動(dòng)作，每次聚攏翻滾夾板的旋轉(zhuǎn)角度為30°；完成后收集溶液皿中的液體，編號為3#液體；