[發明專利]一種膠基型煙草制品對唾液總細菌影響的檢測方法

在審

• 申請號: 201710988313.6
• 申請日: 2017-10-21
• 公開（公告）號: CN107699611A
• 公開（公告）日: 2018-02-16
• 發明（設計）人: 高茜;李雪梅;陸舍銘;米其利;朱洲海;管瑩;徐玉瓊;夭建華
• 申請（專利權）人: 云南中煙工業有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/06
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司53100
• 代理人: 金耀生,于洪

1.一種膠基型煙草制品對唾液總細菌影響的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟（1），采集健康志愿者唾液，編號為1#液體；

步驟（2），將膠基型煙草制品放入模擬咀嚼機中，并分多次注入步驟（1）采集到的唾液，進行人工咀嚼，咀嚼過程中，收集不同咀嚼時間點的唾液；

步驟（3），將步驟（2）收集到的不同咀嚼時間點的唾液與采集到的唾液一起放入厭氧培養箱于37℃下進行共培養；之后分別提取各時間點的培養液中唾液總細菌DNA，同時提取多種口腔細菌標準菌株混合物的原始DNA；

步驟（4），以濃度梯度稀釋10倍的多種口腔細菌標準菌株混合物的原始DNA作為模板進行熒光定量PCR分析，之后繪制熒光定量PCR標準曲線；

同時，分別以各時間點的培養液中唾液總細菌DNA作為模版進行熒光定量PCR分析，空白對照模板采用滅菌雙蒸水，根據標準曲線計算各時間點培養液中唾液總細菌含量；

其中，熒光定量PCR反應所使用的上游引物為5’- cgctagtaatcgtggatcagaatg-3’；下游引物為5’-tgtgacgggcggtgtgta-3’；探針為FAM-cacggtgaatacgttcccgggc-TAMRA。

2.根據權利要求1所述的膠基型煙草制品對唾液總細菌影響的檢測方法，其特征在于，步驟（2）的具體方法為：

將0.8-1.2g膠基型煙草制品放入全仿真模擬咀嚼機的溶液皿中，注入步驟（1）采集到的唾液5mL，進行人工咀嚼；設置咀嚼機械齒以5秒一次的頻率進行上下咬合且左右磨錯動作，共20次，咬合寬度為15mm；同時，啟動左右開合旋轉組件，每隔4次上下咬合且左右磨錯動作做一次聚攏翻滾動作，每次聚攏翻滾夾板的旋轉角度為45°；完成后收集溶液皿中的液體，編號為2#液體；

第二次再注入步驟（1）采集到的唾液5mL，進行人工咀嚼；設置咀嚼機械齒以10秒一次的頻率進行上下咬合且左右磨錯動作，共10次，咬合寬度為10mm；同時，啟動左右開合旋轉組件，每隔5次上下咬合且左右磨錯動作做一次聚攏翻滾動作，每次聚攏翻滾夾板的旋轉角度為30°；完成后收集溶液皿中的液體，編號為3#液體；

第三次再注入步驟（1）采集到的唾液5mL，進行人工咀嚼；設置咀嚼機械齒以5秒一次的頻率進行上下咬合且左右磨錯動作，共30次，咬合寬度為8mm；同時，啟動左右開合旋轉組件，每隔5次上下咬合且左右磨錯動作做一次聚攏翻滾動作，每次聚攏翻滾夾板的旋轉角度為90°；完成后收集溶液皿中的液體，編號為4#液體。

3.根據權利要求2所述的膠基型煙草制品對唾液總細菌影響的檢測方法，其特征在于，步驟（3）的具體方法為：

（3.1）共培養：取步驟（2）中的2#液體、3#液體和4#液體及步驟（1）中的1#液體，每種液體均分為3等份，分別放入厭氧培養箱于37℃下進行共培養，每種液體3等份的培養時間分別為0h、2h、6h三個時間段；

（3.2）培養液中唾液總細菌DNA的提取：取出步驟（3.1）的培養后的培養液50μL置于無菌1.5mL離心管中，之后在4℃、轉速為12000r/min下離心10min，除去上清液，再加入50 μL微生物裂解緩沖液，混合均勻后，置于80℃下熱變性15min，然后在1000r/min下離心1min，取上清液，即得到培養液中唾液總細菌DNA；

（3.3）多種口腔細菌標準菌株混合物的原始DNA的提取：取不少于5種口腔細菌標準菌株的混合物1mL，混合物中每種口腔細菌標準菌株濃度均為10⁸CFU/mL，置于1.5mL離心管中，12000 r/m離心5min后，棄上清，加入50μL微生物PCR裂解液，在80℃下熱變性15min，然后在1000r/m下離心10s，取上層清液，即得到多種口腔細菌標準菌株混合物的原始DNA；

所述的微生物PCR裂解液為Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR。

4.根據權利要求3所述的膠基型煙草制品對唾液總細菌影響的檢測方法，其特征在于，口腔細菌標準菌株的混合物中包括變形鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌、金黃色葡萄球菌、放線菌中的至少一種。