[發明專利]一種利用熒光顯微鏡快速挑選秀麗線蟲的方法

在審

• 申請號: 201710985381.7
• 申請日: 2017-10-20
• 公開（公告）號: CN108387557A
• 公開（公告）日: 2018-08-10
• 發明（設計）人: 安曉萌
• 申請（專利權）人: 香港大學深圳醫院
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 深圳市合道英聯專利事務所(普通合伙) 44309
• 代理人: 廉紅果;侯峰

本發明公開了一種利用熒光顯微鏡快速挑選秀麗線蟲的方法，屬于生物技術領域。一種利用熒光顯微鏡快速挑選秀麗線蟲的方法，步驟為：將瓊脂糖溶液在載玻片上制備成瓊脂糖固定墊，通過注射油將線蟲蟲體固定在瓊脂糖固定墊上，使用倒置熒光顯微鏡觀察線蟲蟲體中熒光信號的表達，在體視顯微鏡下，滴加恢復緩沖液至檢測到熒光信號的線蟲上方，等線蟲浮起并開始活動后挑至培養板上，常規培養。本發明解決了現有技術無法對熒光表達信號低的轉基因線蟲進行篩選的技術難題，操作簡便、成本低、效率高、且對蟲體無損傷。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種使用熒光顯微鏡快速挑選熒光表達信號極低的轉基因線蟲。

背景技術

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)是第一個完成全基因組測序的動物，其基因組編碼的約20,000個基因中有約40％在人類中有同源基因存在，因此成為發育生物學、遺傳學和行為學研究中的重要模式生物，其最大優勢是能夠從分子生物學和細胞生物學水平研究整體系統的相關生命活動的作用機理。轉基因技術在這些研究中發揮了重要的作用。

專利2006100528215，公開了一種轉基因昆蟲熒光基因表達相對量無損傷測定方法，具體是通過熒光體現顯微鏡觀察轉基因昆蟲個體，然后用攝影設備和圖像處理軟件將獲得的圖像進行處理，然后通過專用的軟件進行計算，但是該方法步驟繁瑣，難于操作，且成本高。

傳統的線蟲轉基因方法是通過顯微注射使線蟲獲得可以遺傳的染色體外DNA陣列，這種攜帶DNA陣列的轉基因線蟲中轉基因的拷貝數多、表達量高、信號強。由于轉入蟲體的外源基因通常帶有綠色熒光蛋白(GFP)，可以直接在熒光體視顯微鏡下從培養板上挑取成功轉入目的基因的線蟲進行后續實驗，然而，此項技術要求熒光體視顯微鏡有較高的光學分辨率和較大的工作距離。DNA陣列雖然在線蟲中可以穩定遺傳，但因為表達量高，在線蟲生殖腺中往往被沉默難以表達，另外目的基因過量表達也會導致線蟲發育缺陷甚至死亡。在線蟲中實現基因的單拷貝插入，成為目前研究的熱點。2008年，等首次利用Mos1轉座子在外源轉座酶的幫助下，將外源序列以單拷貝的形式插入到目的染色體位點。近年來迅速發展的人工核酸內切酶為高效、精確的條件性基因編輯提供了更加方便有效的工具，轉錄激活因子樣效應因子核酸酶(transcription activator-likeeffector nuclease,TALEN)和II型成簇規律間隔短回文重復序列[type II clusteredregularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associatedprotein(Cas)9]是目前廣泛使用的兩類人工核酸酶。2013年，Dickinson等首次報道了在線蟲中利用CRISPR-Cas9及同源重組在目標基因位點插入GFP標簽的方法，跟傳統轉基因方法相比，這種帶有GFP標簽的融合蛋白最大限度的反映了內源性基因的生物學功能

同時，基因編輯技術的發展也對線蟲實驗技術提出了巨大的挑戰，例如轉基因熒光線蟲的觀察和篩選方法。不同實驗都發現將GFP標簽插入到一些在生物體內表達水平極低的內源基因內，由于產生的融合蛋白熒光信號過低從而無法通過熒光體視顯微鏡進行觀測和篩選。在本專利提出之前，對此問題沒有令人滿意的解決方案。

發明內容

本發明是為了解決現有技術存在的上述問題，而提供了一種利用熒光顯微鏡快速挑選秀麗線蟲的方法。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種利用熒光顯微鏡快速挑選秀麗線蟲的方法，步驟為：

將瓊脂糖溶液在載玻片上制備成瓊脂糖固定墊，通過注射油將線蟲蟲體固定在瓊脂糖固定墊上，使用倒置熒光顯微鏡觀察線蟲蟲體中熒光信號的表達，在體視顯微鏡下，滴加恢復緩沖液至檢測到熒光信號的線蟲上方，等線蟲浮起并開始活動后挑至培養板上，常規培養。

進一步地，上述方法的具體步驟為：