[發明專利]一種用于肺癌驅動基因及易感基因早篩的核酸質譜檢測方法

在審

• 申請號: 201710984492.6
• 申請日: 2017-10-20
• 公開（公告）號: CN107513578A
• 公開（公告）日: 2017-12-26
• 發明（設計）人: 尚小云;劉慧瑩;雷菁;刁波
• 申請（專利權）人: 武漢賽云博生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司31253
• 代理人: 馮子玲

技術領域

本發明屬于基因檢測領域，具體涉及一種用于肺癌驅動基因及易感基因早篩的核酸質譜檢測方法。

背景技術

肺癌是我國的頭號癌癥殺手，在我國每年新增的65.3萬例肺癌患者中，非小細胞肺癌(NSCLC)患者占到了85％。與大多數癌癥的生存率穩定上升相比，肺癌的治療進展緩慢。通常，肺癌患者的5年生存率為16％，如果早期診斷，肺癌患者的5年生存率則上升至52％。然而，如果發生轉移，到了Ⅳ期將降低到4％以下。不幸的是，一半以上肺癌患者在確診的時候就已經是Ⅳ期肺癌了。面對肺癌，絕對是一場與時間賽跑的生命之戰，早發現、早確診、早治療，才有可能戰勝病魔。目前肺癌的早期診斷主要是根據病史中的高危因素，并結合影像學、支氣管內鏡、細胞學及分子生物學等技術手段進行早期篩查，從而達到早發現早治療的目的。

肺癌的發生、發展以及治療與基因變異關系密切，給予基因變異的“個體化”靶向治療是繼傳統放化療后腫瘤領域的新突破。非小細胞肺癌(NSCLC)樣本中基因靶點變異可從相應的靶向藥物治療中獲益，針對EGFR和ALK基因變異的酪氨酸激酶抑制劑(TLI)吉非替尼(gefitinib)/厄洛替尼(erlotinib)和克唑替尼(crizotinb)等靶向治療可延長患者的生存期。隨著研究深入，ROS1、RET、ERBB2，STK11等分子變異被逐步確定為肺癌的驅動基因(driver gene)。

SNP(single nucleotide polymorphism)，即單核昔酸多態性標記，主要是指由基因組核昔酸水平上的變異引起的DNA序列多態性，它是基因組中最為廣泛存在的一類多態性標記，占大約90％。這些基因組序列變異可以導致個體間表型的差異以及不同個體對疾病，特別是復雜疾病的易感性和對環境因素、藥物反應的差異。SNP在疾病基因定位中所發揮的作用主要包括：1.在疾病定位區域中尋找致病SNP，這種SNP的出現可能直接導致了基因轉錄水平上和翻譯水平上的變化，即改變了基因表達量或者基因產物蛋白質的組成結構，從而導致某種疾病發生或使得個體對某種特殊的環境易感；2.SNP作為一個遺傳標記，與疾病或表型緊密連鎖。

腫瘤發生發展、靶向治療后耐藥以及轉移機制等分子靶點的復雜性分析，以及對肺癌患者樣本多靶點變異基因變異基因進行單基因檢測的局限性，傳統的基因分型檢測方法成本高，不能實現高通量檢測和高通量分析，決定了在臨床轉化醫學研究中開展多基因檢測平臺的必要性與緊迫性。目前LungCarta試劑盒可檢測26個癌癥相關基因的214個突變位點，但技術信息保密，價格昂貴，且未完全包括前沿分子靶點，也未考慮東亞和歐美地區驅動基因譜的差異性，因此建立適合中國人群的多基因檢測方法具有重要意義。

平臺應用先進的質譜技術，一張核酸質譜芯片可以進行384個樣本的檢測，每個樣本可以實現最多36個基因位點的檢測，為基因組學的研究提供了無與倫比的靈敏度和特異性。基于MassARRAY平臺的iPLEX技術利用單堿基延伸技術和基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜技術，可以實現多重擴增反應基因型檢測。

發明內容

本發明為了克服現有技術的上述不足，提供了一種用于肺癌驅動基因及易感基因早篩的核酸質譜檢測方法，此方法能檢測肺癌11種驅動和耐藥相關基因的29個亞洲人熱點變異位點和14種易感基因的20個亞洲人SNPs位點。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：

一種用于肺癌驅動基因及易感基因早篩的核酸質譜檢測方法，該方法包括如下步驟：

(1)篩選出可用來評估個體罹患肺癌風險的特異性和敏感性的基因突變位點和易感基因的SNPs位點，并進行位點的組合；

(2)設計步驟(1)的用來評估個體罹患肺癌風險的特異性和敏感性的基因突變位點和易感基因的SNPs位點的擴增引物和單堿基延伸引物；

(3)將步驟(2)中的擴增引物分為6組，各組中所含的各SNP位點和基因突變位點的上下游引物混合，得到對應的6組擴增引物混合液；

(4)對應于步驟(3)中擴增引物分組的方式，將步驟(2)中的單堿基延伸引物分為6組，分別得到6組單堿基延伸引物混合液；

(5)以待測樣本基因組DNA為模板，對步驟(3)中的6組擴增引物混合液分別進行PCR擴增；

(6)蝦堿式磷酸酶消化步驟(5)反應體系中剩余的dNTP；

(7)利用步驟(6)中各組相對應的單堿基延伸引物對步驟(6)消化后的產物進行單堿基延伸反應，獲得延伸產物；

(8)脫鹽樹脂純化延伸產物；