[發明專利]利用群體感應分子誘導從樺褐孔菌中提取三萜類物質方法

在審

• 申請號: 201710981074.1
• 申請日: 2017-10-19
• 公開（公告）號: CN107841523A
• 公開（公告）日: 2018-03-27
• 發明（設計）人: 陳啟和;李豪;吳嘉南;牛永武
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12P33/00
• 分類號: C12P33/00;C12P5/02;C12N1/14;C12N1/38;C12R1/645
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司33224
• 代理人: 沈自軍

技術領域

本發明涉及微生物發酵及代謝領域，尤其涉及一種利用群體感應分子誘導從樺褐孔菌中提取三萜類物質的方法。

背景技術

樺褐孔菌(Inonotus obliquus)是一種十分珍稀而名貴的藥用真菌，屬于真菌門、擔子菌亞門、層菌綱、非褐菌目、多孔菌科、褐臥孔菌屬。主要分布于俄羅斯、芬蘭、波蘭、日本北海道等北半球北緯40°～50°的地區和我國的黑龍江大興安嶺、吉林長白山一帶。從16世紀以來，俄羅斯、波蘭、芬蘭等國家的民間就廣泛使用樺褐孔菌來治療各種疑難雜癥，如各種癌癥、心臟病和糖尿病等。

樺褐孔菌是生長在寒帶的木腐菌，引起白樺、銀樺、榆樹、赤楊的白腐。在木材中的樺褐孔菌菌絲在零下40℃也不會凍死，是極耐寒的種類。樺褐孔菌的形態特征：菌核呈現瘤狀(不育性的塊狀物)，外表黑灰，有不規則溝痕，內部黃色，無柄，直徑25～40cm，深色，表面深裂，很硬，干時脆，可育部分厚5mm，皮殼狀薄，暗褐色；菌管3～10mm，脆、通常菌管的前端開裂，菌孔每mm 6～8個，圓形，淺白色，后變暗褐色；菌肉木柱質，有輕微的、模糊不清的環紋，鮮(明亮)淡黃褐色。孢子呈闊橢圓狀至卵狀，光滑，9～10μm×5.5～6.5μm，有剛毛。

樺褐孔菌含有多糖、三萜類、樺褐孔菌醇、多種氧化三萜類化合物、栓菌酸、多種羊毛甾醇型三萜類化合物、葉酸衍生物、芳香族的香草酸、丁香酸及γ羥基苯甲酸，還有報道稱已分離出單寧化合物、類固醇、生物堿類化合物、黑色素類、低分子多酚類及木質素類化合物。

三萜類物質的藥理研究成果表明其具有抗腫瘤、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎鎮痛、免疫調節保肝、提高動物免疫力和在胚胎細胞發育過程中的調控作用等多種活性，此外，在抗氧化、抗糖尿病、調節心血管系統等方面均呈現出較好的生物活性。

白樺脂酸(Betulinic acid，BA)，又名樺木酸，是一種五環三萜類化合物。廣泛分布于多種植物中，如鼠李科的酸棗仁、樺木科的白樺樹皮、豆科的皂角刺、薔薇科的光皮木瓜、五加科刺五加、大戟科重陽木、錦葵科木芙蓉花等。最早分離于生長在非洲東部的鼠李科常綠植物的樹皮。在我國，白樺脂酸最豐富的自然資源是白樺樹皮。近年研究表明，白樺脂酸具有諸多的生物活性，如抗腫瘤、抗HIV、抗炎、抗菌、抗瘧疾等，尤其是在抗腫瘤方面，特別是針對黑色素瘤，有突出的表現。同時還具有作用機制特異、分子質量小、低毒性等優點，有廣泛的應用開發前景，是一類很有潛力的藥物先導化合物。

目前，研究表明，樺褐孔菌中可以分離到三萜類物質。但是，在實驗過程中，發現從樺褐孔菌中直接提取三萜類物質時，得到的量非常低，所以希望找到一種更為高效的提高三萜類物質產量的方法。

群體感應是當菌體的數量達到一定密度時才能發生的感應現象，指的是在一個特定的環境中當菌體的數量急劇增加時，由它所分泌的信號分子的濃度也會相應升高，當其達到一個閾值水平時，菌體之間就會通過發信號來調整它們的共同行為，對較高的細胞密度作出共同的感應。

群體感應分子指的介導在菌體細胞與細胞間信息交流而引發的群體感應過程中的自體誘導物或特殊的、微小的、可擴散的信息素。菌體通過這些群體感應分子時刻監控著它們的生存環境。在菌體數量較少時，分泌的信號分子濃度較低，菌體之間保持著一種沉默寡言或處在不具備攻擊能力的狀態。但是，當菌體的數量急劇增加的時候，此時的細胞會通過發信號，改變和協調它們之間的行為，共同表現出它們的某些生理特性，從而更有利于整個種群的代謝活動和生理功能。

發明內容

本發明提供了一種利用群體感應分子誘導從樺褐孔菌中提取三萜類物質方法，該方法無需引入基因工程菌株、外加酶，后處理簡單，能有效提高樺褐孔菌中三萜類物質，特別是白樺脂酸的產量。

一種利用群體感應分子誘導從樺褐孔菌中提取三萜類物質的方法，包括：將活化的樺褐孔菌(Inonotus obliquus)CFCC 83414接入液體培養基，于24-26℃發酵培養8-14天，在發酵第5-8天加入群體感應分子，發酵完成后，分離菌體和發酵液，通過后處理從菌體和發酵液中分離純化得到三萜類物質；

其中，所述群體感應分子為法尼醇、色醇、對羥基苯乙醇、苯乙醇、茴香腦和香葉醇中的至少一種；

所述三萜類物質為白樺脂醇、白樺脂酸、角鯊烯和羊毛甾醇中的至少一種。