[發明專利]一種基于CRISPR/Cas9體系的同源修復載體構建方法

在審

• 申請號: 201710981059.7
• 申請日: 2017-10-20
• 公開（公告）號: CN107937427A
• 公開（公告）日: 2018-04-20
• 發明（設計）人: 歐陽樂軍;李莉梅;徐錫榮;劉雅麗;柳鏡炬;梁裕華
• 申請（專利權）人: 廣東石油化工學院
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/82
• 代理公司: 廣州市南鋒專利事務所有限公司44228
• 代理人: 李慧

技術領域

本發明涉及一種基于CRISPR/Cas9體系的同源修復載體構建方法，具體涉及一種用于構建cDNA文庫構建篩選的質粒載體的方法，屬于基因工程技術領域。

背景技術

CRISPR/Cas9基因組定向編輯技術是近幾年發展起來的對基因組進行定向精確修飾的一種技術。通過將外源的DNA導入受體細胞染色體的特定位點上，從而特異地改造基因組，研究基因的功能。該技術可以對基因組中的靶位點進行缺失、敲入、核苷酸修正等操作。2013年，科學家第一次將CRISPR/Cas9應用到人類和小鼠細胞系中對基因進行敲除，隨后人們在模式植物和其他農作物中也成功獲得了應用，經過改造的 CRISPR/Cas9系統也迅速地被應用到擬南芥、煙草、高粱、水稻、小麥、玉米等不同植物基因組的定向編輯研究中，并且獲得較高的誘導突變率和可穩定遺傳的基因組編輯植株。相對于轉基因技術，CRISPR/Cas9系統具有操作簡單、快捷、不需要巨大的資金投入、在遺傳編輯之后不留下轉基因的痕跡，無須引用外源基因，因而生物安全性高，不具有轉基因爭議。

目前為止，利用CRISPR/Cas9統實現基因組的定向編輯還只能對內源基因的定向敲除，還無法實現定點引入外源基因，對全面研究基因的功能起到一定的限制作用。因此，以現有的CRISPR/Cas9載體為基礎，構建一種能實將外源基因定點交換到內源基因位置，真正實現對目標生物基因組的定點編輯功能的CRISPR/Cas9系統，為植物定點轉基因改良、新基因定點引入等具有重要意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種能實將外源基因定點交換到內源基因位置，真正實現對目標生物基因組的定點編輯功能的CRISPR/Cas9系統的方法，載體構建只需通過一步 PCR，簡單易行，無需對酶切載體與PCR產物純化回收，組裝效率高。

為實現上述發明的目的，本發明采取的技術方案如下：

一種基于CRISPR/Cas9體系的同源修復載體構建方法，包括如下步驟：

(1)靶位點設計

sgRNA靶位點的選擇使用CRISPR在線設計工具(http://crispr.dbcls.jp/)，以擬南芥AS基因為靶基因，選擇靠近5'端得分最高的G-N19-NGG 23bp序列，其中第一個G 是小RNA轉錄的起始信號位點，NGG是Cas9基因定位的PAM序列，需要插入gRNA 載體的是G-N19共20bp序列，共設計兩個打靶位點的Target，實現大片段敲除；同時在AS基因的打靶載體上裝入AS基因的同源修復片段，實現AS基因在CAS9敲除的同時，以載體上的AS基因的同源臂做模板進行修復。

(2)引物設計

所用引物見表1。

表1本研究所用引物信息

Table 1Primersμsedinthis stμdy

注：下劃線部分表示同源末端序列，加粗斜體部分為靶位點序列

Note,Μnderlinedis thehomologoμs arms ofPHDE andtheboldseqμence is the target locμs.

(3)打靶載體PHDE-ASgRNA的構建

①PCR擴增目的片段：PCR反應總體積共100μL，平均分裝至2個PCR小管；PCR 反應條件為98℃預熱4min，40個循環(98℃45s，55℃10s，72℃30s)，72℃保溫；

②瓊脂糖凝膠電泳純化與目的片段回收：1.5％瓊脂糖凝膠電泳PCR產物，在紫外透照臺上切下目的條帶，將目的條帶裝入1.5mL EP管，-4℃冷凍20min，15000rpm低溫離心20min，吸取上清液于PCR小管中，測定濃度，記錄OD₂₆₀/OD₂₈₀，-20℃保存；

③PHDE質粒的酶切和鑒定：酶切體系總體積20μL，50℃恒溫過夜，然后以酶切前的PHDE質粒作對照，配制0.5％的瓊脂糖凝膠進行電泳分析；

④目的片段與載體重組：取一個PCR小管，先后加入0.3μL線性化PHDE載體、 3μL重組酶以及1.2μL回收的AS基因片段，采用重組酶技術，將回收純化后的AS基因片段與BsaI酶切線性化的載體重組連接，組裝條件為50℃恒溫反應1h；